生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法技术

本发明专利技术属于一种药物制备方法，具体地说是一种从生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法。由于丙型肝炎病毒复制能力极强，药物难以渗透进病毒体内，病毒难以杀灭，丙型肝炎也就难以治愈。现有技术是用抗病毒西药治疗，只能使患者短时期减轻症状，无法根治疾病。本发明专利技术方法是：准确称取生姜２０重量份，粉碎至１００目，加入１１０重量份９５％乙醇浸泡２ｈ；用索氏提取器对上述样品８０℃热回流４ｈ；将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至２０重量份；将浓缩后的溶液过滤除菌，用ＤＭＥＭ培养液稀释。本发明专利技术的优点是：原料便宜，成本低；方法简单，提取方便；对丙型肝炎病毒有直接杀灭效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种药物制备方法，具体地说是一种从生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药 物的方法。
技术介绍
丙型肝炎是一种严重危害人类健康的疾病，难以治愈。丙型肝炎是由人体感染丙 型肝炎病毒引起的疾病。由于丙型肝炎病毒复制能力极强，病毒表面有一层坚硬外壳，一般 的药物难以渗透进病毒体内，所以病毒难以杀灭，丙型肝炎也就难以治愈。现有技术是用抗 病毒西药治疗，但是由于丙型肝炎病毒构造的特殊性，只能使患者短时期减轻症状，无法根 治疾病。所以专利技术一种从植物中提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，生产对人体无副作用， 能够有效杀灭丙型肝炎病毒的药物是一个重要的任务。生姜是大众日常生活中喜爱的食品，长期以来被认为有抗病防病作用。但是对于 从生姜中提取杀灭丙型肝炎病毒的物质则没有见报道；对于用什么方法提取生姜中含有的 杀灭丙型肝炎病毒物质没有见报道。经检索国内外专利文献，查阅国内外公开出版物均未 见有从生姜中提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法的报道。本专利技术利用安全、经济和便捷的 生姜原料来提取杀灭丙型肝炎病毒的药物，对于治疗丙型肝炎具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。本专利技术的目的是这样实现的从，步骤如下a生姜洗净晾干，准确称取20重量份，破碎，加入110重量份的95%乙醇浸泡2h ；b用索氏提取器对上述样品进行80°C热回流4h ；c将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至20重量份；d将浓缩后的溶液过滤除菌，用DMEM培养液稀释。生姜为姜科姜属多年生宿根草本植物的地下肉质根茎。DMEM培养液为含氨基酸和葡萄糖的培养基。本专利技术的要点是将生姜粉碎，经95%乙醇浸泡、80°C热回流、过滤、浓缩、除菌、 用DMEM培养液稀释制成。临床使用时根据需要配制成不同浓度药物。本专利技术的具体实施如下；将Huh-7. 5. 1细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中于37°C、5% C02 (CO2)饱 和湿度的培养箱中培养，细胞培养液中添加100μ g/ml的链霉素和100U/ml的青霉素。此 细胞为贴壁细胞，培养3天后，用0. 25%胰蛋白酶消化进行传代培养。HCVcc滴度为每毫升 培养上清IO5感染单位，保存于-80°C冰箱备用。生姜购于农贸市场，洗净、晾干。称取生姜20g，粉碎后用95%乙醇120ml (110克) 浸泡2h。随后用索氏提取器对样品分别进行80°C热回流4h，再过滤，将样品液用旋转蒸发仪浓缩至20ml，此为提取原液即1ml提取液含lg原材料的提取物(浓度为lg/ml)。在细 胞室内将4份提取原液进行过滤除菌后，分别用DMEM培养液进行1 10、1 50,1 100、 1 200,1 1000 稀释，得到浓度分别为 100mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、lmg/ml 的生姜提取液。生姜提取液处理HCVcc具有一定的直接杀灭效果，其机制是影响病毒RNA的合成。本专利技术的优点是1、原料便宜，成本低。2、方法简单，提取方便。3、对丙型肝炎病毒有直接杀灭效果。具体实施例方式下面通过具体实施方式对本技术做进一步说明。实施例1 提取液对Huh-7. 5. 1细胞毒性测定用胰酶消化Huh-7. 5. 1细胞，按2X104/孔的密度接种至96孔细胞培养板，置5% C02培养箱37°C培养6h，待细胞贴壁后，在每孔中分别加入不同浓度的各类提取液lOiil， 37°C培养过夜，在每孔中加入lOiUCCK-8试剂，继续培养4h。同时设立阴性对照(未加提 取液的细胞孔，加CCK-8)、空白对照(没有细胞，加DMEM培养液，加CCK-8)。用酶标仪测定 各孔450nm吸光度值(0D值)。实施例2 为筛选提取液有无抗HCV活性及其作用的强弱，以及发挥抗病毒作用的途径，设 计以下三组平行实验第一组杀灭病毒取20mg/ml、5mg/ml、lmg/ml 3个浓度的生姜提取液各10 u 1首先和10 u 1 HCVcc 等量混合，37°C作用4h后，再接种到96孔板内(其中H6h-7. 5. 1细胞密度为3X104/孔， 下同)，培养72h后，进行IFA实验，检测细胞内HCV蛋白表达。以HCVcc直接感染的一个孔 为阳性对照、以未加提取液、病毒的一个孔为阴性对照。第二组阻断病毒感染将lOiU不同浓度提取液首先加到含有Huh-7. 5. 1细胞的96孔板内，培养过夜， 弃培养液，用PBS洗涤3次，每孔添加100 u 1培养液后再加10 u 1 HCVcc进行病毒感染，同 时设立阳性、阴性对照。培养72h后进行IFA检测。第三组抑制病毒增殖将10 ill HCVcc感染96孔板内的Huh_7. 5. 1细胞，培养6h，弃培养液，用PBS洗 涤3次，每孔添加100 yl培养液后再加10 yl不同浓度提取液，同时设立阳性、阴性对照， 培养72h后进行IFA检测。实施例3 IFA检测将96孔板中的培养上清吸掉，每孔加入lOOiU甲醇，置_20°C固定 20min，PBS洗涤3次，每次3min。每孔加入0. 1% TritonX-100 (用PBS配制)100 yl，室温 透化30min，PBS洗涤(3minX3次)。每孔加入含3% BSA的PBS 100 yl封闭液，室温封闭1小时。吸掉封闭液，每孔加入丙型肝炎患者血清50μ1 (用封闭液做1 50稀释的血清， 作为第一抗体)，室温孵育2h，PBS洗涤(10minX3次)。每孔加入荧光素FITc标记的抗人 IgG作为第二抗体，避光孵育1小时，PBS洗涤(3minX3次)。实施例4 FQ-PCR检测细胞总RNA的提取和纯化将100 μ 1 HCVcc感染6孔板内的 Huh-7. 5. 1细胞，培养6h后，弃培养液，用PBS洗涤3次，每孔添加2ml培养液后，分别加入 浓度为lmg/ml、5mg/ml、20mg/ml的丁香液(醇提)，培养72后分别收集消化后的细胞，以 3000rpm离心5min去上清。使用RNArose Reagent,按其操作步骤提取总RNA，用DEPC水溶 解，再用酚·氯仿抽提法纯化RNA，再用DEPC水溶解总RNA并测定浓度。RNA的逆转录纯化后的总RNAl μ g，随机引物(0. 5 μ g/ml) 1 μ 1，DEPC处理水补足 至11 μ 1,混勻，于65°C水浴5min，立即冰浴2min，然后加入5XM-MLV buffer 5μ 1，IOMm dNTP 1. 5 μ 1，逆转录酶M-MLV 1 μ 1，DEPC水补足至25 μ 1，混勻，于37°C水浴Ih以合成 cDNA模板。FQ-PCR检测cDNA模板2 μ 1，2X SYBR GreenI 10 μ 1，HCV特异的正向引物和反向 引物(10 μ M)各0.2 μ 1，双蒸水7.6 μ 1，混合后在Smart Cycler定量PCR仪上按以下程序 扩增95°C预变性Imin ；94°C变性5s，60°C退火20s，72°C延伸10s，在延伸步骤末采集荧光 信号，共35个循环；融解曲线分析72°C 95°C，0. 1°C /秒。按标准曲线法进行定量HCV 检测的标准品是含有全长HCV cDNA的质粒pGEM-J4 (浓度梯度为7 X IO3 IO8拷贝/ μ 1) 绘制的标准曲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，步骤如下：ａ生姜洗净晾干，准确称取２０重量份，破碎，加入１１０重量份的９５％乙醇浸泡２ｈ；ｂ用索氏提取器对上述样品进行８０℃热回流４ｈ；ｃ将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至２０重量份；ｄ将浓缩后的溶液过滤除菌，用ＤＭＥＭ培养液稀释。

【技术特征摘要】
一种从生姜提取杀灭丙型肝炎病毒药物的方法，步骤如下a生姜洗净晾干，准确称取20重量份，破碎，加入110重量份的95％乙醇浸泡2h；b用索氏提取器对上述样品进行80℃热回流4h；c将上述溶液过滤；过滤后的溶液用旋转蒸发仪浓缩至20重量份；d将浓缩后的溶液过滤除菌，...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚传凤，杨宇，
申请(专利权)人：姚传凤，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]