【技术实现步骤摘要】
本申请属于重组蛋白表达，具体涉及his-sumo标签在制备重组hpv18 e7蛋白中的应用。
技术介绍
1、重组蛋白是指应用重组dna或重组rna技术而获得的蛋白质，通常是先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因，连接到适合的表达载体，导入到特定的宿主细胞，利用宿主细胞的遗传系统，表达出有功能的蛋白质分子并进行蛋白纯化。在构建表达载体阶段，除了一些必要的表达元件，还需要考虑密码子优化和标签的选择。
2、在实际生产中，标签种类较多，如his、gst、mbp、nusa、sumo等，针对不同的重组蛋白，其效果并不相同。因此，寻找合适的蛋白标签成为研发的重点。与此同时，分子量较大的标签可能会遮挡目的蛋白的活性位点，且具有一定的免疫原性，摸索一套适配目的蛋白的标签以及标签切除技术，可使目的蛋白达到最佳的使用效果。
3、宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤，研究表明，几乎所有宫颈癌与人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，hpv)密切相关。高危型hpv的e7蛋白在hpv感染的细胞中持续高表达，并在宫颈癌的发生发展中起重要作用，但其具体致病机制尚不明确。
4、目前hpv18 e7蛋白在大肠杆菌中存在表达量低以及纯化效果不好的情况，大多用gst标签进行促溶表达。陈晓黎等人通过gst融合大标签进行重组表达，表达上清主带不强，且没有切除大标签，最终得到少量带gst标签的hpv18 e7重组蛋白；来永巍通过gst融合标签重组表达，利用prescission protease蛋白酶进行标签切除，最终得到
技术实现思路
1、1.专利技术目的
2、本申请的专利技术目的是提供his-sumo标签在制备重组hpv18 e7蛋白中的应用，通过his+sumo标签诱导可溶性hpv18 e7融合蛋白(his-sumo-hpv18 e7)的高效表达，并利用亲和层析纯化以及标签切除技术，制备不含多余标签氨基酸序列的重组hpv18 e7蛋白(notag hpv18 e7)，解决现有技术中hpv18 e7可溶性表达量低和/或含大分子标签的问题。
3、2.技术方案
4、为了达到上述专利技术目的，本申请所采用的技术方案如下：
5、本申请提供了his-sumo标签在制备重组hpv18 e7蛋白中的应用。
6、进一步地，上述重组hpv18 e7蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7、进一步地，上述his-sumo标签的氨基酸序列如seq id no.4所示。
8、进一步地，上述应用包括如下步骤：
9、s1，融合质粒构建，该融合质粒为含有编码融合蛋白his-sumo-hpv18e7的多核苷酸序列的表达载体；
10、s2，融合蛋白表达，将s1中的融合质粒转化至大肠杆菌并诱导表达，收集大肠杆菌菌体，破碎菌体、离心收集上清液，上清液中含有融合蛋白his-sumo-hpv18e7；
11、s3，融合蛋白纯化，采用ni-smart琼脂糖凝胶亲和层析对s2中的上清液进行纯化，得到高纯度的融合蛋白his-sumo-hpv18e7；
12、s4，融合蛋白酶切，利用sumo酶进行酶切，得到酶切混合液；
13、s5，重组蛋白纯化，采用ni-smart琼脂糖凝胶亲和层析对s4中的酶切混合液进行纯化，获得高纯度不带标签的重组hpv18 e7蛋白。
14、进一步地，上述s1融合质粒构建中，编码重组hpv18 e7蛋白的多核苷酸序列如seqid no.5所示。
15、进一步地，上述s1融合质粒构建中，编码his-sumo标签的多核苷酸序列如seq idno.8所示。
16、进一步地，上述s1融合质粒构建中，编码融合蛋白his-sumo-hpv18e7的多核苷酸序列如seq id no.7所示。
17、进一步地，上述s1融合质粒构建中，表达载体包括pet-28a。
18、进一步地，上述s2融合蛋白表达具体包括：s1中的融合质粒转化大肠杆菌、接种，扩大培养，诱导表达，收集菌体，破碎菌体，离心收集上清液。
19、进一步地，上述s3融合蛋白纯化具体包括：用pbs缓冲液平衡ni-smart层析柱至基线平稳；0.5ml/min流速进行上样；上样结束后，用含0.5m nacl和25mm咪唑的pbs清洗层析柱至基线平稳；用含0.5m nacl和500mm咪唑的pbs洗脱目的蛋白；超滤置换成pbs缓冲液，除去0.5m nacl和500mm咪唑，得到高纯度的融合蛋白his-sumo-hpv18e7。
20、进一步地，上述s4融合蛋白酶切具体包括：融合蛋白和sumo酶的质量比为20:1，30℃酶切1h，得到酶切混合液，酶切混合液含不带标签的重组hpv18 e7蛋白、切掉的带his标签的sumo标签以及带his标签的sumo酶。
21、进一步地，上述s5重组蛋白纯化具体包括：用pbs缓冲液平衡ni-smart层析柱至基线平稳；0.1ml/min流速将酶切混合液上样；收集流穿液，得到高纯度不带标签的重组人乳头瘤病毒hpv18 e7蛋白。
22、本申请还提供了重组hpv18 e7蛋白的生产方法，具体包括：
23、s1，融合质粒构建，该融合质粒为含有编码融合蛋白his-sumo-hpv18e7的多核苷酸序列的表达载体；
24、s2，融合蛋白表达，将s1中的融合质粒转化至大肠杆菌并诱导表达，收集大肠杆菌菌体，破碎菌体、离心收集上清液，上清液中含有融合蛋白；
25、s3，融合蛋白纯化，采用ni-smart琼脂糖凝胶亲和层析对s2中的上清液进行纯化，得到高纯度的融合蛋白；
26、s4，融合蛋白酶切，利用sumo酶进行酶切，得到酶切混合液；
27、s5，重组蛋白纯化，采用ni-smart琼脂糖凝胶亲和层析对s4中的酶切混合液进行纯化，获得高纯度不带标签的重组hpv18 e7蛋白。
28、3.有益效果
29、本申请与现有技术相比，其有益效果在于：
30、(1)本申请提供的his-sumo标签在制备重组hpv18 e7蛋白中的应用，通过his+sumo标签表达体系以及酶切技术可制备获得不带标签的可溶性重组人乳头瘤病毒hpv18e7蛋白；制备的重组人乳头瘤病毒hpv18 e7蛋白sds-page电泳条带清晰且单一，重复性好，产量高(达到20.5mg/l)，蛋白纯度可达99％，可以有效地应用于规模化生产重组人乳头瘤病毒hpv18 e7蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.His-SUMO标签在制备重组HPV18 E7蛋白中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组HPV18 E7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述His-SUMO标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述编码融合蛋白His-SUMO-HPV18E7的多核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述S2融合蛋白表达具体包括：S1中的融合质粒转化大肠杆菌、接种，扩大培养，诱导表达，收集大肠杆菌菌体，破碎菌体，离心收集上清液。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述S3融合蛋白纯化具体包括：用PBS缓冲液平衡Ni-Smart层析柱至基线平稳；0.5mL/min流速进行上样；上样结束后，用含0.5MNaCl和25mM咪唑的PBS清洗层析柱至基线平稳；用含0.5M NaCl和500mM咪唑的PBS洗脱目的蛋白；超滤置换成PBS缓冲
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述S4融合蛋白酶切具体包括：融合蛋白和SUMO酶的质量比为20:1，30℃酶切1h，得到酶切混合液。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述S5重组蛋白纯化具体包括：用PBS缓冲液平衡Ni-Smart层析柱至基线平稳；0.1mL/min流速将酶切混合液上样；收集流穿液，得到不带标签的重组HPV18 E7蛋白。
9.一种重组HPV18 E7蛋白的生产方法，其特征在于，所述方法包括：
10.根据权利要求9所述的一种重组HPV18 E7蛋白的生产方法，，其特征在于，所述编码融合蛋白His-SUMO-HPV18E7的多核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
...【技术特征摘要】
1.his-sumo标签在制备重组hpv18 e7蛋白中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组hpv18 e7蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述his-sumo标签的氨基酸序列如seq id no.4所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述编码融合蛋白his-sumo-hpv18e7的多核苷酸序列如seq id no.7所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述s2融合蛋白表达具体包括：s1中的融合质粒转化大肠杆菌、接种，扩大培养，诱导表达，收集大肠杆菌菌体，破碎菌体，离心收集上清液。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述s3融合蛋白纯化具体包括：用pbs缓冲液平衡ni-smart层析柱至基线平稳；0.5ml/min流速进行上样；上样结束后，用含0.5mnacl和...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈昌盛，潘红阳，吴丽丽，赵鹏程，方文秀，
申请(专利权)人：杭州斯达特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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