【技术实现步骤摘要】
【】本专利技术是有关于一种微生物的基因编辑技术，特别是一种维斯假丝酵母的基因编辑系统及其应用。
技术介绍
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技术介绍
1、维斯假丝酵母(candida viswanathii)是一种萌芽酵母，可以自发地将长链烷烃转化为相应的酸/二酸，并通过β-氧化途径将其作为碳源消耗生长。经由代谢工程改良后的基因编辑菌种在工业应用上是为一种很有前景的细胞工厂，例如可阻断参与相关氧化代谢途径的催化酶，但同时保留及/或强化将烷烃转化为酸/二酸的关键催化酶，令其可稳定且持续消耗烷烃，并将体内碳通量更集中地投入酸/二酸化学品的生产中。
2、然而，现今维斯假丝酵母的基因编辑工程仍多以高压选择性的同源重组方式来进行，不仅重组机率低，且一次的基因编辑过程中只能针对一个基因进行编辑，同时也非常受限于剔除/嵌入的编辑片段的大小及编辑位置，十分费力且耗时。再者，维斯假丝酵母为一种具有多个同源染色体的二倍体酵母，由于其准性生殖的特性，在生殖过程中有机会因不进行减数分裂，而是在多次的有丝分裂中逐渐丢失部分染色体再恢复成原本的倍性，进而造成编辑片段的缺失或重组，大大地增加基因编辑工程的菌株不稳定性及操作难度。
3、crispr-cas9基因编辑技术在近几年已被广泛运用在各模式生物中，其对染色体精准且无痕的靶向编辑技术克服了生物学相关领域所面临的编辑效率及编辑技术瓶颈。相对地，crispr-cas9基因编辑技术虽具有优异的剪切能力，但其cas9蛋白的表达盒再加上用于靶向引导cas9蛋白剪切的sgrna已颇为庞大，同时，若再把其他需
技术实现思路
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技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的一目的是在于提供一种维斯假丝酵母的基因编辑系统及维斯假丝酵母的基因编辑方法，通过将crispr-cas9系统导入维斯假丝酵母，并经由筛选启动子、第一核酶及第二核酶的组合以及优化同源臂的重组策略，以克服具有二倍体的维斯假丝酵母在基因编辑时的操作困难及低重组率。再者，利用本专利技术的维斯假丝酵母的基因编辑系统及维斯假丝酵母的基因编辑方法，不仅可缩短基因编辑的时程，也大大提高了基因编辑的成功率及精准度，可方便快速地实现剔除、突变、置换或片段插入等基因编辑而不受片段大小或插入位置所限制，进而获得稳定的维斯假丝酵母的转化株。
2、此外，本专利技术的另一目的是在于提供一种生产十二烷二酸的转化株及生产十二烷二酸的方法，通过本专利技术的维斯假丝酵母的基因编辑系统，可编辑出一种可稳定生产十二烷二酸的转化株，所述转化株的染色体中带有将十二烷转化成十二烷二酸所需催化酶的外源基因。更进一步地，利用本专利技术的生产十二烷二酸的转化株，可持续且高效地发酵生产高纯度的十二烷二酸，其发酵过程中无须添加抗生素或诱导物，且发酵产物中除了十二烷二酸外几乎没有其他副产物，非常适合经济地大量工业化制造，不仅可降低生物发酵的培养及纯化成本，也在化学品生产领域中达成友善环境的循环经济。
3、本专利技术的一态样是在于提供一种维斯假丝酵母的基因编辑系统，包含一维斯假丝酵母、一第一基因编辑片段以及一第二基因编辑片段。所述第一基因编辑片段包含依序排列的一第一同源臂及一筛选基因。第二基因编辑片段连接于第一基因编辑片段的c端，且所述第二基因编辑片段包含依序排列的一第二同源臂、一cas9表达盒及一sgrna盒，其中所述cas9表达盒包含依序排列的一cas9启动子、一cas9基因和三核定位序列，所述sgrna盒包含依序排列的一sgrna启动子、一第一核酶、一靶向序列、一支架序列和一第二核酶，第一基因编辑片段与第二基因编辑片段构成一线性片段，用以对维斯假丝酵母的染色体进行基因编辑。其中所述第一同源臂和所述第二同源臂分别与所述维斯假丝酵母的所述染色体上一基因的一特定片段相对应，所述靶向序列与所述维斯假丝酵母的所述染色体上所述基因的一特定序列相对应。
4、依据前述的维斯假丝酵母的基因编辑系统，其中所述第一基因编辑片段的筛选基因可更包含第一筛选基因片段，所述第二基因编辑片段于第二同源臂的n端可更包含筛选基因的第二筛选基因片段，且第一筛选基因片段和第二筛选基因片段可分别具有同源片段，第一基因编辑片段和第二基因编辑片段通过所述同源片段重组连接为所述线性片段。
5、依据前述的维斯假丝酵母的基因编辑系统，其中第一基因编辑片段及/或第二基因编辑片段可更包含至少一表达盒，所述至少一表达盒包含一外源基因启动子以及一外源基因。
6、本专利技术的另一态样是在于提供一种维斯假丝酵母的基因编辑方法，包含建构一第一基因编辑片段、建构一第二基因编辑片段、进行一转化步骤以及进行一转化株培养步骤。所述第一基因编辑片段包含依序排列的一第一同源臂及一筛选基因。第二基因编辑片段连接于第一基因编辑片段的c端，且所述第二基因编辑片段包含依序排列的一第二同源臂、一cas9表达盒及一sgrna盒，其中所述cas9表达盒包含依序排列的一cas9启动子、一cas9基因和三核定位序列，所述sgrna盒包含依序排列的一sgrna启动子、一第一核酶、一靶向序列、一支架序列和一第二核酶，第一基因编辑片段与第二基因编辑片段构成一线性片段，用以对维斯假丝酵母的染色体进行基因编辑，其中所述第一同源臂和所述第二同源臂分别与所述维斯假丝酵母的所述染色体上一基因的一特定片段相对应，所述靶向序列与所述维斯假丝酵母的所述染色体上所述基因的一特定序列相对应。进行一转化步骤，其系将所述第一基因编辑片段和所述第二基因编辑片段转化至所述维斯假丝酵母中，以得到一转化株。进行一转化株培养步骤，其系在一编辑温度下以一筛选培养物将所述转化株培养一编辑时间，其中cas9表达盒表达cas9基因且sgrna盒表达靶向序列，第一同源臂和第二同源臂分别与特定片段同源重组，将位于第一同源臂和第二同源臂间的部分的第一基因编辑片段及第二基因编辑片段嵌入转化株的基因中。
7、依据前述的维斯假丝酵母的基因编辑方法，其中所述第一基因编辑片段的筛选基因可更包含第一筛选基因片段，所述第二基因编辑片段于第二同源臂的n端可更包含筛选基因的第二筛选基因片段，且第一筛选基因片段和第二筛选基因片段可分别具有同源片段，第一基因编辑片段和第二基因编辑片段通过所述同源片段重组连接为所述线性片段。
8、依据前述的维斯假丝酵母的基因编辑方法，其中所述第一基因编辑片段及/或所述第二基因编辑片段可更包含至少一表达盒，所述至少一表达盒包含一外源基因启动子以及一外源基因。
9、本专利技术的再一态样是在于提供一种生产十二烷二酸的转化株，包含一宿主细胞以及至少二外源基因。所述宿主细胞为一维斯假丝酵母(candida viswanathii)。所述至少二外源基因包含本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种维斯假丝酵母(Candida viswanathii)的基因编辑系统，其特征在于，包含：
2.如权利要求1所述的维斯假丝酵母的基因编辑系统，其特征在于，该第一基因编辑片段的该筛选基因更包含一第一筛选基因片段，该第二基因编辑片段于该第二同源臂的N端更包含该筛选基因的一第二筛选基因片段，且该第一筛选基因片段和该第二筛选基因片段分别具有一同源片段，该第一基因编辑片段和该第二基因编辑片段通过该同源片段重组连接为该线性片段。
3.如权利要求2所述的维斯假丝酵母的基因编辑系统，其特征在于，该第一基因编辑片段及/或该第二基因编辑片段更包含至少一表达盒，该至少一表达盒包含一外源基因启动子以及一外源基因。
4.一种维斯假丝酵母的基因编辑方法，其特征在于，包含：
5.如权利要求4所述的维斯假丝酵母的基因编辑方法，其特征在于，该第一基因编辑片段的该筛选基因更包含一第一筛选基因片段，该第二基因编辑片段于该第二同源臂的N端更包含该筛选基因的一第二筛选基因片段，且该第一筛选基因片段和该第二筛选基因片段分别具有一同源片段，该第一基因编辑片段和该第二基因编
6.如权利要求4所述的维斯假丝酵母的基因编辑方法，其特征在于，该第一基因编辑片段及/或该第二基因编辑片段更包含至少一表达盒，该至少一表达盒包含一外源基因启动子以及一外源基因。
7.一种生产十二烷二酸的转化株，其特征在于，包含：
8.如权利要求7所述的生产十二烷二酸的转化株，其特征在于，该至少二外源基因包含CYP52A18基因。
9.如权利要求7所述的生产十二烷二酸的转化株，其特征在于，该至少二外源基因嵌入该宿主细胞的该染色体的POX2基因中。
10.如权利要求7所述的生产十二烷二酸的转化株，其特征在于，该至少二外源基因包含FAO2基因。
11.如权利要求7所述的生产十二烷二酸的转化株，其特征在于，该至少二外源基因包含POS5基因。
12.一种生产十二烷二酸的方法，其特征在于，包含：
...【技术特征摘要】
1.一种维斯假丝酵母(candida viswanathii)的基因编辑系统，其特征在于，包含：
2.如权利要求1所述的维斯假丝酵母的基因编辑系统，其特征在于，该第一基因编辑片段的该筛选基因更包含一第一筛选基因片段，该第二基因编辑片段于该第二同源臂的n端更包含该筛选基因的一第二筛选基因片段，且该第一筛选基因片段和该第二筛选基因片段分别具有一同源片段，该第一基因编辑片段和该第二基因编辑片段通过该同源片段重组连接为该线性片段。
3.如权利要求2所述的维斯假丝酵母的基因编辑系统，其特征在于，该第一基因编辑片段及/或该第二基因编辑片段更包含至少一表达盒，该至少一表达盒包含一外源基因启动子以及一外源基因。
4.一种维斯假丝酵母的基因编辑方法，其特征在于，包含：
5.如权利要求4所述的维斯假丝酵母的基因编辑方法，其特征在于，该第一基因编辑片段的该筛选基因更包含一第一筛选基因片段，该第二基因编辑片段于该第二同源臂的n端更包含该筛选基因的一第二筛选基因片段，且该...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡育诚，范玉南，周俊彥，王兴运，刘珈男，
申请(专利权)人：胡育诚，
类型：发明
国别省市：
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