【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒检测，具体涉及一种用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒。
技术介绍
1、传染性脾肾坏死病毒(infection spleen and kidney necrosis virus,isknv)俗称鳜爆发性传染病，是以脾、肾坏死为主要病理特征的一种病毒性疾病，可引起淡水养殖鳜爆发性死亡，严重危害我国鳜养殖业发展。传染性脾肾坏死病毒在海洋和淡水养殖鱼类中流行广泛，其中，它对鳜鱼造成的死亡率接近100％，已成为制约鱼类养殖业持续发展的重要因素之一。为了更好地防止疾病爆发，在加强研究安全、方便、特效且适用于渔业生产的疫苗的同时还应加强对传染性脾肾坏死病毒疾病检测，预防病毒的传播和流行，尤其是对苗种的检测，保证苗种不携带病毒对于减少该病毒的发生具有重要意义。
2、我国目前尚无isknv诊断的国家标准，一般进行isknv诊断的方法主要包括病理切片诊断、ifat检测、pcr检测以及病理分离检测。但是这些方法普遍具有滞后性，pcr检测相对其它几种检测方法相对较为灵敏，但是由于pcr检测过程中无法进行封闭，易造成检测室的核酸气溶胶污染，容易出现假阳性的结果，因此，仍旧难以满足苗种预防的检测。
3、因此，如何建立一种灵敏度更高、特异性更强且更准确的方法用于苗种的筛选和isknv的监测与流行病学的调查，具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术所存在的问题，本专利技术提供了一种用于传染性脾肾坏死病毒监测的试剂盒，该试剂盒特异性强且不容易出现假阳性，其灵敏度能达到
2、本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，包括
3、试剂a，试剂a包括试剂a1、试剂a2、试剂a3，试剂a1为正向引物试剂，试剂a2为反向引物试剂、试剂a3为探针试剂，所述试剂a1、a2、a3单独储存或者混合储存，其中，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，探针序列的核苷酸序列如seq id no:4所示；
4、试剂b：试剂b为pcr预混液，其内含有ung酶、datp、dctp、dgtp、dutp、dna聚合酶。
5、在本专利技术中，试剂a、b既可以单独保存，也可以将两者混合后进行储存，使用时，只需要添加模板即可，方便使用。混合时，两者通常以8-12：1的体积比进行混合。
6、作为一种优选的实施方式，试剂b由ung酶、datp、dctp、dgtp、dutp、dttp、dna聚合酶、tris-hci、kc1、dtt、tween 20、甘油和纯水制备而成。
7、作为一种优选的实施方式，探针序列的5’端标记有荧光染料，3’端标记有淬灭基团。
8、作为一种优选的实施方式，所述荧光染料包括但不限于fam，淬灭基团包括但不限于bhq2。
9、作为一种优选的实施方式，q-pcr时，正向引物、反向引物的终浓度为0.2-1.0μmol/l，探针的终浓度为0.1-1.0μmol/l，ung酶的酶活为0.5-1.5u，datp的终浓度为150-250μm，dctp的终浓度为150-250μm，dgtp的终浓度为150-250μm，dutp的终浓度为50-150μm，dttp的终浓度为50-150μm，dna聚合酶的酶活为0.5-1.5u。
10、优选的，q-pcr时，正向引物、反向引物的终浓度为0.2μmol/l，探针的终浓度为0.1μmol/l。
11、进一步，该试剂盒还包括阳性标准品，所述阳性标准品为含有鳜鱼脾肾坏死病毒mcp基因的质粒。
12、本专利技术的目的还在于提供一种非疾病的诊断和治疗为目的的传染性脾肾坏死病毒的检测方法，包括以下步骤：
13、s1，提取待测样本中的病毒基因组dna；
14、s2，以上述基因组dna为模板，使用权利要求1所述的试剂盒进行q-pcr扩增，然后进行数据分析和判定：
15、判定规则为：阳性标准品有典型扩增曲线，阴性标准品没有扩增曲线且无ct值，若样本出现典型的s扩增曲线，且ct≤35，则判定样品传染性脾肾坏死病毒阳性，如果35<ct≤40，判断样本为可疑样本，进行复检，如果复检结果还是可疑，则将样本判定为阳性，如果样本没有出现相应的扩增曲线或者ct>40，则判定样本为阴性。
16、其中，反应体系为：浓度均为10μmol/l的试剂a1和试剂a2各0.4μl，浓度为10μmol/l的试剂a3 0.2μl，试剂b10μl，dna模板4μl，无菌无核酸酶水补足至20μl。
17、其中，扩增程序为：50℃5min；95℃30s，95℃5s，60℃30s，共计40个循环。
18、本专利技术所提供的试剂盒相对于现有技术，具有更高的灵敏度以及特异性，能够有效避免因非特异性扩增而产生的假阳性，灵敏度能达到现有技术的10倍，可用于苗种的筛选；并且根据仪器实时读取的荧光信号不仅可以对检测的结果进行评估，且可以依据ct值以及绝对定量的标准曲线对待测样本感染的病毒载量进行评估，可以初步评估出鳜鱼感染病毒的程度，进而进行具体的药物推荐治疗，将养殖户的损失降低到最低的水平，完全满足了临床诊断的要求，为检测鳜鱼脾肾坏死病毒提供了更加简洁便利的途径。
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1.一种用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括
2.根据权利要求1所述的用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，试剂B由UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、dTTP、DNA聚合酶、Tris-HCI、KC1、DTT、吐温-20、甘油和纯水制备而成。
3.根据权利要求1所述的用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，探针序列的5’端标记有荧光染料，3’端标记有淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料包括但不限于FAM，淬灭基团包括但不限于BHQ2。
5.根据权利要求1所述的用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，Q-PCR时，正向引物、反向引物的终浓度为0.2-1.0μmol/L，探针的终浓度为0.1-1.0μmol/L，UNG酶的酶活为0.5-1.5U，dATP的终浓度为150-250μM，dCTP的终浓度为150-250μM，dGTP的终浓度为150-250μM，dUTP的终浓度为50-150μM，dTTP的终浓度为50-150
6.根据权利要求5所述的用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，Q-PCR时，正向引物、反向引物的终浓度为0.2μmol/L，探针的终浓度为0.1μmol/L。
7.根据权利要求1所述的用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，还包括阳性标准品，所述阳性标准品为含有鳜鱼脾肾坏死病毒MCP基因的质粒。
8.一种非疾病的诊断和治疗为目的的传染性脾肾坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应体系为：浓度均为10μmol/L的试剂A1和试剂A2各0.4μL，浓度为10μmol/L的试剂A3 0.2μL，试剂B10μL，DNA模板4μL，无菌无核酸酶水补足至20μL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，扩增程序为：50℃5min；95℃30s，95℃5s，60℃30s，共计40个循环。
...【技术特征摘要】
1.一种用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括
2.根据权利要求1所述的用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，试剂b由ung酶、datp、dctp、dgtp、dutp、dttp、dna聚合酶、tris-hci、kc1、dtt、吐温-20、甘油和纯水制备而成。
3.根据权利要求1所述的用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，探针序列的5’端标记有荧光染料，3’端标记有淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料包括但不限于fam，淬灭基团包括但不限于bhq2。
5.根据权利要求1所述的用于传染性脾肾坏死病毒检测的试剂盒，其特征在于，q-pcr时，正向引物、反向引物的终浓度为0.2-1.0μmol/l，探针的终浓度为0.1-1.0μmol/l，ung酶的酶活为0.5-1.5u，datp的终浓度为150-250μm，dctp的终浓度为150-250μm，dgtp的终浓度为150-250μm，d...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘梦梅，蔡亮亮，余勇，张奇，吴勤超，
申请(专利权)人：武汉华扬天乐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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