【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶催化以及生物制药，具体涉及一种重组基因工程菌及(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法。
技术介绍
1、洛普替尼(repotrectinib tpx-0005)是一种抑制ros1、trk和alk活性的广谱新一代酪胺酸激酶抑制剂(tki)。它可以克服多种对其他tki产生抗性的基因突变，并能杀死携带ros1或ntrk基因融合的多种肿瘤细胞，因此非常有潜力治疗ros1阳性的nsclc，以及ros1、ntrk和alk阳性的实体瘤。为ros1融合及耐药的患者提供了全新的治疗选择，对于ros1阳性的非小细胞肺癌，repotrectinib显示出超越其他靶向药的疗效，二线数据一枝独秀，而且在一线治疗中100％的脑转移控制率和100％的临床获益率更是令人惊艳。repotrectinib身为多靶点抑制剂，在对抗黑色素瘤、甲状腺癌、肺腺癌、结肠癌、胃肠道间质瘤等实体瘤上的巨大潜力。
2、(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚作为洛普替尼的中间体，其高效和绿色的合成方法成为人们关注的焦点，美国的tp therapeutics公司公布的世界专利wo2017007759公开了一类广谱的蛋白激酶调节剂，能够有效针对多种获得性的突变，从而提供一种全新的治疗癌症的方法。该方法是通过r-叔丁基亚磺酰胺作为手性辅剂，然后在低温(-65℃)条件下，通过甲基溴化镁和亚胺中间体，发生亲核加成反应，从而获得手性中心；后脱掉保护基团叔丁基亚磺酰基得到目标产物。该方法使用的初始原料2-羟基-5-氟苯甲醛以及手性辅剂r-叔丁基亚磺酰胺价格
3、总之，合成手性胺的化学方法存在步骤长，成本高，产量低以及反应条件较难操作等缺点。而目前酶催化合成方法需要用到催化剂酶、辅酶、助溶剂缓冲液等，且后续处理也需要用到较多试剂并在低温条件下处理，如需大量生产成本较高。因此，针对(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚酶合成方法，如何设计新的合成路线，并选择恰当的酶催化剂和合成条件，这是本领域亟需解决的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的问题，本专利技术的目的在于提供一种重组基因工程菌及(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的高效制备方法。
2、一种重组基因工程菌，它是包含胺脱氢酶或甲酸脱氢酶中至少一种酶的对应基因的重组菌。
3、优选的，所述重组菌为重组大肠杆菌。
4、优选的，所述胺脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.4所示。
5、优选的，所述胺脱氢酶的对应基因核苷酸序列如seq id no.1所示；所述甲酸脱氢酶的对应基因核苷酸序列如seq id no.3所示。
6、本专利技术还提供一种(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法，包括如下步骤：
7、将5-氟-2-羟基苯乙酮原料、辅因子和酶催化剂加入缓冲溶液反应，即得(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚；
8、其中，所述辅因子为nad+；
9、所述酶催化剂是上述重组基因工程菌，或含有胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的粗酶液。
10、优选的，所述胺脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.4所示。
11、优选的，所述缓冲溶液为甲酸铵缓冲溶液；所述反应时使用氨水ph为8～9；所述反应的温度为30～60℃；反应的时间为15～25h。
12、优选的，所述5-氟-2-羟基苯乙酮和酶总质量的投料质量比为50～100:1；所述酶总质量为所述胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量之和；所述5-氟-2-羟基苯乙酮和缓冲溶液的投料质量体积比为1g:20～50ml。
13、优选的，所述粗酶液的制备方法为：
14、步骤(1)，将权利要求1-4任一项所述重组基因工程菌培养至菌体密度od600值达到0.8；
15、步骤(2)，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至浓度为0.8～1mm，继续培养至od600值达到7～8；
16、步骤(3)，离心收集菌体，加入磷酸盐缓冲液重悬菌体后，超声破碎菌悬液，离心，上清液即为所述粗酶液；
17、其中，
18、步骤(1)中，所述培养的培养基为lb液体培养基，培养温度为20-37℃；步骤(2)中，所述加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至其浓度为0.1-1mm；步骤(2)中，所述培养的温度为20-28℃；步骤(2)中，所述od600值为2-8；步骤(3)中磷酸盐缓冲液的ph为7-8。
19、优选的，所述5-氟-2-羟基苯乙酮和所述粗酶液的投料质量比为10～20:1。
20、本专利技术首先构建了一种具有高选择性、高活性的胺脱氢酶和甲酸脱氢酶，然后利用该两种酶作为催化剂构建出一个高效和可再生的循环系统，提供了一种重要的医药中间体手性(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法。氧化还原酶比如胺脱氢酶大多依赖辅酶nadph或nadh进行催化反应，是手性化合物合成的重要生物催化剂，然而辅酶会随着产物的生成而消耗，同时nad(p)h的高成本阻碍了其大规模生产。因此本专利技术在反应系统中加入第二种氧化还原酶，以牺牲廉价的底物回收辅因子，构建一个高效、低成本的辅因子再生体系。
21、目前常见的催化氨基转移的酶为转氨酶，此酶可以手性催化氨基酸与酮酸之间氨基转移，但转氨酶有一些缺点，比如转氨酶需要辅酶磷酸吡哆醛参与转氨基作用，此辅酶成本较高；另外转氨酶由于底物结合区域特殊的空间结构，因此在底物特异性、稳定性、催化效率等方面存在诸多不足，目前满足工业应用需求的转氨酶仍较为有限。本专利技术涉及的双酶联用系统能够高选择性、高稳定性、高转化率的催化制备(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚。本专利技术制备方法的ee值大于99.9％，高于现有技术cn107586796a中单独的转氨酶催化得到(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的ee值(99.5％)。
22、此外，本专利技术以5-氟-2-羟基苯乙酮为原料，经过两种酶一步酶催化获得(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚，过程中只需要用到缓冲液，无需助溶剂和其他试剂，很大程度节约了成本。且本专利技术制备方法简化了下游分离精制工艺，是一种过程简洁、绿色环保、成本降低的新工艺。
23、综上所述，本专利技术具有工业化的潜力和良好的应用前景。
24、显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
25、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
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1.一种重组基因工程菌，其特征在于：它是包含胺脱氢酶或甲酸脱氢酶中至少一种酶的对应基因的重组菌。
2.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组菌为重组大肠杆菌。
3.按照权利要求2所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述胺脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.按照权利要求3所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述胺脱氢酶的对应基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲酸脱氢酶的对应基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述胺脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为甲酸铵缓冲溶液；所述反应时使用氨水pH为8～9；所述反应的温度为30～60℃；反应的时间为15～
8.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述5-氟-2-羟基苯乙酮和酶总质量的投料质量比为50～100:1；所述酶总质量为所述胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量之和；所述5-氟-2-羟基苯乙酮和缓冲溶液的投料质量体积比为1g:20～50mL。
9.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述粗酶液的制备方法为：
10.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述5-氟-2-羟基苯乙酮和所述粗酶液的投料质量比为10～20:1。
...【技术特征摘要】
1.一种重组基因工程菌，其特征在于：它是包含胺脱氢酶或甲酸脱氢酶中至少一种酶的对应基因的重组菌。
2.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组菌为重组大肠杆菌。
3.按照权利要求2所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述胺脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.4所示。
4.按照权利要求3所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述胺脱氢酶的对应基因核苷酸序列如seq id no.1所示；所述甲酸脱氢酶的对应基因核苷酸序列如seq id no.3所示。
5.一种(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述胺脱氢酶的氨基酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵海燕，王雪英，杨运航，汪铭，周国军，郭鹏，
申请(专利权)人：爱斯特成都生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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