【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，尤其涉及一种脐带间充质干细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
1、人源脐带干细胞(umbilical cord derived stem cells，ucscs)是近年来从人脐带组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。ucscs不仅可以定向分化为脂肪、软骨、心肌细胞等多种细胞；还可分泌多种促进血管生成因子、凋亡因子等多种具有生物学活性的细胞因子。此外，脐带属于围产组织，ucscs具有取材容易、获取量大、不会对供体产生任何副作用等优点。目前已被广泛应用于组织工程及再生医学领域。研究结果显示，间充质干细胞(mscs)mscs不仅可以分化成新神经元，来修复卒中后的脑组织，还可通过调节神经组织的微环境，减轻卒中区的炎症反应，促进神经血管修复以及血管再生、神经发生、等，通过减少梗死面积和减轻血脑屏障破坏的作用。
2、目前，大部分体外培养的干细胞是在21％常氧条件下进行，而人体正常组织的氧含量为3％～10％，器官氧含量为1％～5％，骨髓腔内氧含量为1％～7％，动脉血氧含量为12％，静脉血氧含量为5％，因此传统间充质干细胞体外培养氧环境不能真正模拟体内干细胞的氧环境，但大量的研究表明，间充质干细胞移植后存活率明显下降，移植后24小时内，超过90％的干细胞发生坏死或凋亡，这些均严重影响了干细胞的应用疗效。如何解决间充质干细胞移植的存活性，成为疾病治疗的首要难点。
3、卒中后认知障碍(post-stroke cognitive impairment，psci)是指在卒中事件后出现并持续到6个月时
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种脐带间充质干细胞的制备方法及其应用为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
2、第一方面，本专利技术提供一种含药血清培养基，所述培养基包括条件培养基和含药血清；所述含药血清为用中药组方提取物灌胃处理大鼠的血清；所述中药组方按重量份包括以下成分：黄芪20-40份、人参5-7份、何首乌10-20份、当归10-20份、天麻5-7份、远志5-7份、巴戟天10-20份、法半夏5-7份、石菖蒲5-7份。
3、本专利技术的中药组方，通过各个中药的合理配伍，能够有效对卒中后认知障碍进行治疗。其中，方中以人参(生晒参)为“君药”，起到大补元气的作用；以黄芪、当归、制何首乌、巴戟天起增补气血之功用，有益精髓之力，作为“臣药”。而黄芪、当归、天麻、法半夏、菖蒲、远志进行配伍，又能够起到益气通脉、补血活血、豁痰通络的辅佐效果；石菖蒲和远志具有豁痰开窍、宣通神机的功效。本专利技术利用中药成分和静脉内皮细胞分泌的外泌体，对脐带间充质干细胞的成血管能力进行“诱导”；经低氧和含药血清诱导处理后的脐带间充质干细胞，其定向分化为脂肪、软骨、心肌细胞等多种细胞的能力增强。
4、更优选地，所述中药组方按重量份包括以下成分：黄芪30份、人参6份、何首乌15份、当归15份、天麻6份、远志6份、巴戟天15份、法半夏6份、石菖蒲6份。
5、作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，所述条件培养基和含药血清的体积比为条件培养基：含药血清＝1：(0.2-0.3)。
6、作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，所述中药组方提取物的制备包括以下步骤：称取中药组方，加入1000-1200ml的水，浸泡25-30min后大火煮沸，随后小火煎煮至500-600ml并趁热过滤，浓缩滤液获得中药组方提取物。
7、作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，所述中药组方提取物的浓度为132.3mg/ml。
8、作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，所述含药血清的制备包括以下步骤：用含中药组方的提取物对大鼠进行灌胃处理，结束后对大鼠进行采血处理，纯化后得到含药血清；所述灌胃处理的频率为每天3次，连续7天；所述灌胃处理中，中药组方提取物的用量为5ml/次。本专利技术通过优选上述灌胃处理的频率，能够进一步提高中药小分子在大鼠血清中的浓度。
9、作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，所述采血处理包括以下步骤：在灌胃处理末次给药1h后，麻醉大鼠并在腹主动脉采血，得到含药原血；将含药原血室温静置2h后，在3500r/min，4℃下离心10min，分离血清，在56℃热处理30min进行灭活，0.22um滤膜过滤，得到含药血清。
10、作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，所述条件培养基的制备方法为：用完全培养基培养脐带静脉内皮细胞p3代细胞24-56h后，分离培养体系上清，得到条件培养基。所述脐带静脉内皮细胞用完全培养基进行传代培养，培养至48-56h时，脐带静脉内皮细胞会分泌外泌体，所述外泌体位于培养上清中。脐带静脉内皮细胞分泌的外泌体中，包含了生长因子、细胞因子、蛋白质等。这些营养因子可以促进细胞的生长、增殖和分化，维持细胞的正常功能。
11、因此，将脐血静脉内皮细胞经过48h分泌外泌体的条件培养基作为基础成分，复合“含复方中药成份”的血清作为ucscs的细胞培养体系，协同低氧培养的条件，既能够提供间充质干细胞培养所需的营养成分，同时能够模拟人体服食中药后，间充质干细胞收到中药药物成分的诱导后分化能力增强的效果。经过该培养方式，制备的间充质干细胞，应用于卒中后认知障碍的治疗时，能够通过其分化能力多水平调控血管内皮细胞的致密程度，同时易于透过脑血屏障，改善脑梗区(缺血缺氧区)的脑组织的情况。
12、第二方面，本专利技术提供了一种脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
13、(1)脐带间充质干细胞原代培养和传代培养：分离脐带中的沃顿胶，原代培养后分离脐带间充质干细胞，继续传代培养，得到p3-p5代的脐带间充质干细胞；
14、(2)含药血清低氧处理：取步骤(1)所述的p3-p5代的脐带间充质干细胞，在低氧条件下用含药血清培养基培养至细胞融合率为90％，收集并重悬细胞，得到分化能力增强的脐带间充质干细胞。本专利技术利用含药血清培养基培养脐带间充质干细胞，模拟人体服食中药后，诱导间充质干细胞成血管能力的效果。
15、作为本专利技术所述方法优选的实施方式，步骤(1)中，所述脐带间充质干细胞原代培养具体包括以下步骤：取健康足月剖腹产婴儿的脐带，清洗后剥离脐带羊膜和1条动脉和2条静脉，取出沃顿胶；将沃顿胶剪碎至1-3cm3，用完本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种含药血清培养基，其特征在于，所述包括条件培养基和含药血清；所述含药血清为用中药组方提取物灌胃处理大鼠的血清；所述中药组方按重量份包括以下成分：黄芪20-40份、人参5-7份、何首乌10-20份、当归10-20份、天麻5-7份、远志5-7份、巴戟天10-20份、法半夏5-7份、石菖蒲5-7份。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述中药组方提取物的制备包括以下步骤：称取中药组方，加入1000-1200mL的水，浸泡25-30min后大火煮沸，随后小火煎煮至500-600mL并趁热过滤，浓缩滤液获得中药组方提取物。
3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述含药血清的制备包括以下步骤：用中药组方提取物对大鼠进行灌胃处理，结束后对大鼠进行采血处理，纯化后得到含药血清；所述灌胃处理的频率为每天3次，连续7天；所述灌胃处理中，中药组方提取物的用量为5mL/次。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述条件培养基和含药血清的体积比为条件培养基：含药血清＝1：(0.2-0.3)。
5.如权利要求1所述的培养基，其特征在于
6.一种脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述低氧条件为细胞在氧气含量为1％-3％进行培养。
8.权利要求7-6任一项所述的脐带间充质干细胞的制备方法在制备治疗卒中后认知障碍药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述治疗卒中后认知障碍药物中脐带间充质干细胞的浓度为1×106cells/mL-1×107cells/mL。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述治疗卒中后认知障碍药物的给药方式为注射给药；所述注射给药的频率为0.1-1.0mL/次/周，连续3-5周进行给药；所述注射给药的部位为大脑侧室。
...【技术特征摘要】
1.一种含药血清培养基，其特征在于，所述包括条件培养基和含药血清；所述含药血清为用中药组方提取物灌胃处理大鼠的血清；所述中药组方按重量份包括以下成分：黄芪20-40份、人参5-7份、何首乌10-20份、当归10-20份、天麻5-7份、远志5-7份、巴戟天10-20份、法半夏5-7份、石菖蒲5-7份。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述中药组方提取物的制备包括以下步骤：称取中药组方，加入1000-1200ml的水，浸泡25-30min后大火煮沸，随后小火煎煮至500-600ml并趁热过滤，浓缩滤液获得中药组方提取物。
3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述含药血清的制备包括以下步骤：用中药组方提取物对大鼠进行灌胃处理，结束后对大鼠进行采血处理，纯化后得到含药血清；所述灌胃处理的频率为每天3次，连续7天；所述灌胃处理中，中药组方提取物的用量为5ml/次。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述条件培养基和含药血清的体积比...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁伟海，陈志宁，林国伟，余永森，温玮婕，刘晓俊，
申请(专利权)人：广州市第一人民医院广州消化疾病中心，广州医科大学附属市一人民医院，华南理工大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。