【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体公开了一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法及其应用。
技术介绍
1、前列腺癌是全球第二大常见癌症，也是全球男性癌症相关死亡的第五大原因。大部分前列腺癌患者被诊断患有局部疾病，建议在需要时结合雄激素剥夺疗法(adt)进行主动监测和局部治疗。尽管局部治疗后的治愈率很高，但随着前列腺特异性抗原(psa)水平的升高，部分患者会复发，这被定义为去势抵抗性前列腺癌(crpc)。众所周知，雄激素受体(androgen receptor,ar)通路是前列腺癌发病机制的重要组成部分，因此一直是前列腺癌治疗的主要靶点。ar信号通路抑制剂，如醋酸阿比特龙(aa)和恩杂鲁胺，现已获批并常规用于治疗mcrpc。但如同几乎所有的靶向药物面临的耐药问题一样，恩杂鲁胺等ar信号通路抑制剂在疾病进展后期也大多出现耐药，其耐药机理有多种因素，比如，靶点蛋白的突变或者其他代偿信号通路的激活等。在下一代抗肿瘤药物开发过程中，需要构建体外细胞学模型和动物体内耐药模型。
技术实现思路
1、针对以上问题，本专利技术公开了一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法及其应用。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，包括以下步骤：
4、1)复苏lncap细胞，待lncap细胞生长至正常状态进行细胞铺板；
5、2)细胞铺板后，将培养基更换为不完全培养基，对lncap细胞进行饥饿处理；
6、3)饥饿处理后，将培养基更
7、4)用完全培养基清洗细胞两遍，并更换完全培养基继续培养24h以上；
8、5)添加第一浓度的恩杂鲁胺培养一周；
9、6)使用浓度增加的第二浓度的恩杂鲁胺培养一周；
10、7)使用浓度进一步增加的第三浓度的恩杂鲁胺培养两周；
11、8)培养结束后，挑选单克隆细胞培养放大后，冻存保存；
12、9)耐药鉴定获得对恩杂鲁胺耐药的细胞系；
13、所述第一浓度为恩杂鲁胺对正常lncap细胞的增殖抑制活性ic50值。
14、进一步的，上述一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，所述不完全培养基为不含fbs的rpmi-1640培养基。
15、进一步的，上述一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，所述完全培养基为含10％fbs的rpmi-1640培养基。
16、进一步的，上述一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，所述第一浓度由以下步骤确定：
17、复苏lncap细胞，培养在含10％fbs的rpmi-1640培养基中；首先测试lncap细胞对恩杂鲁胺的药物反应曲线；将lncap细胞按照4000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，培养过夜后，加入三倍等比稀释的恩杂鲁胺，其终浓度范围为50μm-7.6nm，共9个浓度，对照孔中加入含有0.016％的dmso；孵育72小时后，用celltiter-glo细胞活力检测试剂盒检测各孔中的活细胞；用graphpad prism软件拟合计算恩杂鲁胺对lncap细胞的增殖抑制活性ic50值。
18、进一步的，上述一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，所述睾丸酮的浓度优选为50nm；所述乙酰基亚硝基脲enu的浓度优选为0.5或1mg/ml。
19、进一步的，上述一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，所述恩杂鲁胺的第一浓度为3.6μm、第二浓度为10μm、第三浓度为20μm。
20、进一步的，上述一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，所述耐药鉴定包括以下步骤：
21、s1将野生型lncap-wt和待鉴定的耐药株lncap-r细胞分别按照4000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，培养过夜后，加入三倍等比稀释的恩杂鲁胺，其终浓度范围为50μm-7.6nm，共9个浓度，对照孔中加入含有0.016％的dmso；
22、s2孵育72小时后，用celltiter-glo细胞活力检测试剂盒检测各孔中的活细胞，用graphpad prism软件拟合计算恩杂鲁胺对wt-lncap和待鉴定的lncap-r细胞的增殖抑制活性。
23、另一方面，本专利技术公开了一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系，由上述的筛选方法筛选得到。
24、另一方面，本专利技术公开了上述筛选方法或细胞系在制备恩杂鲁胺耐药的荷瘤小鼠模型中的用途。
25、另一方面，本专利技术还公开了上述筛选方法或细胞系在研制针对ar耐药的前列腺癌的药物中的用途。
26、本专利技术具有如下有益效果：
27、本专利技术公开了一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法及其应用，独创了对于lncap细胞的前处理，以及enu处理+睾酮+饥饿的联合运用，不同处理条件下，形成的克隆数不同，最终我们找到了一种最优的处理方案，可以更有效地形成耐药克隆。
28、本专利技术的技术方案可以快速发现对恩杂鲁胺耐药的lncap细胞克隆，可以为针对恩杂鲁胺耐药的下一代ar抑制剂或相关的治疗前列腺癌的药物开发提供体外细胞学和体内药效学评价平台。
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1.一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，所述不完全培养基为不含 FBS的RPMI-1640培养基。
3.根据权利要求1所述的一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，所述完全培养基为含10% FBS的RPMI-1640培养基。
4.根据权利要求1所述的一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，所述第一浓度由以下步骤确定：
5.根据权利要求1所述的一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，所述睾丸酮的浓度优选为50 nM；所述乙酰基亚硝基脲ENU的浓度优选为0.5或1 mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，所述恩杂鲁胺的第一浓度为3.6μM、第二浓度为10μM、第三浓度为20μM。
7.根据权利要求1所述的一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，所述耐药鉴定包括以下步骤：
8.一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系，其特征在于
9.如权利要求1-7任一项所述的筛选方法或如权利要求8所述的细胞系在制备恩杂鲁胺耐药的荷瘤小鼠模型中的用途。
10.如权利要求1-7任一项所述的筛选方法或如权利要求8所述的细胞系在研制针对AR耐药的前列腺癌的药物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，所述不完全培养基为不含 fbs的rpmi-1640培养基。
3.根据权利要求1所述的一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，所述完全培养基为含10% fbs的rpmi-1640培养基。
4.根据权利要求1所述的一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，所述第一浓度由以下步骤确定：
5.根据权利要求1所述的一种对恩杂鲁胺耐药的细胞系的筛选方法，其特征在于，所述睾丸酮的浓度优选为50 nm；所述乙酰基亚硝基脲enu的浓度优选为0.5或1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李恒，关继中，
申请(专利权)人：苏州拓维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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