【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于聚合酶，具体涉及一种具有逆转录酶活性的pfu dna聚合酶突变体及其应用。
技术介绍
1、逆转录实时荧光定量pcr(rt-qpcr)是目前检测rna病毒的金标准。
2、目前的rt-qpcr需要联合使用逆转录酶和taq dna聚合酶。由于目前使用的逆转录酶不耐高温，因此整个检测过程分为两步进行，需要先在较低的温度进行逆转录，然后再升高温度进行pcr；如果待检测rna具有高级结构还需要对样品进行预处理，操作繁琐、费时。而且，混合后两种酶的活性均会受到影响，如延长逆转录时间；另外，taq dna聚合酶会与逆转录酶竞争结合模板，导致在较少模板条件下的检测灵敏度显著降低。因此，开发一种具有高逆转录酶活性的dna聚合酶，对于rna检测领域具有重要意义。
3、作为目前最常用的一种b族聚合酶，pfu dna聚合酶在1991年首次从嗜热古菌pyrococcusfuriosus中分离纯化出来，并验证了其3’→5’外切酶活性以及比taq dna聚合酶更高的酶活。pfu dna聚合酶的分子量约为90kda，有催化5’→3’方向的脱氧核糖核苷酸(dna)聚合的活性，以及3’→5’外切酶(校正)活性，但不具备逆转录活性。pfu dna聚合酶具有包括3’→5’外切酶结构域在内的5个不同的结构域，分别是n-端结构域(1-130，327-368)、3’→5’外切酶结构域(131-326)、手掌结构域(369-450，501-588)、手指结构域(451-500)和拇指结构域(589-775)。
技
1、鉴于天然存在的dna聚合酶已经不能满足在不同研究中的功能要求，本专利技术旨在以pfu dna聚合酶为基础进行理性设计，以期获得具有高逆转录酶活性且保留野生型酶聚合酶活性的pfu dna聚合酶突变体，进而实现单酶“一步法”rt-pcr。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术第一方面提供了一种具有逆转录酶活性的pfu dna聚合酶突变体，具体为以下任一：
4、k467r/f588l/w769r突变体，是将氨基酸序列如seq id no.1所示的pfu dna聚合酶的第467位的赖氨酸(lys,k)突变为精氨酸(arg,r)，同时将第588位的苯丙氨酸(phe,f)突变为亮氨酸(leu,l)，将第769位的色氨酸(trp,w)突变为精氨酸；或
5、r382h/r385h/v390i突变体，是将氨基酸序列如seq id no.1所示的pfu dna聚合酶的第382位和385位的精氨酸突变为组氨酸(his,h)，同时将第390位的缬氨酸(val,v)突变为异亮氨酸(ile,i)；或
6、i38l/r97m突变体，是将氨基酸序列如seq id no.1所示的pfu dna聚合酶的第38位的异亮氨酸突变为亮氨酸，同时将第97位的精氨酸突变为蛋氨酸(met,m)；或
7、e665k/e735k突变体，是将氨基酸序列如seq id no.1所示的pfu dna聚合酶的第665位和735位的谷氨酸(glu,e)同时突变为赖氨酸；或
8、k118i/n713v突变体，是将氨基酸序列如seq id no.1所示的pfu dna聚合酶的第118位的赖氨酸突变为异亮氨酸，同时将第713位的天冬酰胺(asn,n)突变为缬氨酸。
9、本专利技术以氨基酸序列如seq id no.1所示的pfu dna聚合酶(即野生型)为基础进行理性设计，通过同源建模、基于结构对其逆转录活性突变位点进行预测，预测了16个突变位点。本专利技术通过聚合酶链式反应进行工程改造，获得以下突变体蛋白：i38l、r97m、k118i、i137l、r382h、y385h、v390i、k467r、y495l、t515i、i522l、f588l、e665k、n713v、e735k、w769r，然后通过逆转录rna的方法检测突变体活性，若检测到逆转录酶活性，则在此基础上继续引入其他突变位点，以提高逆转录酶活性。筛选结果表明，i137l、y495l、t515i、i522l，这4个突变位点引入任意一个都会造成聚合酶逆转录活性减弱甚至完全丧失逆转录活性；其中，i137l和i522l两个突变位点的引入会导致突变体逆转录进行性减弱，在高酶量时逆转录产物量明显增加；y495l和t515i两个突变位点的引入会导致突变体丧失逆转录活性。通过大量的筛选工作，本专利技术最终获得了具备高效、稳定逆转录酶活性的pfu dna聚合酶突变体，其中k118i/n713v的逆转录活性最强，e665k/e735k次之。
10、本专利技术第二方面提供了与本专利技术所述pfu dna聚合酶突变体相关的生物材料，包括以下：
11、(a)编码pfu dna聚合酶突变体的基因；
12、(b)含有(a)中基因的重组表达载体；
13、(c)含有(a)中基因或(b)中重组表达载体的重组细胞。
14、在本专利技术一实施例中，编码野生型酶的基因序列如seq id no.2所示，编码pfudna聚合酶突变体的基因在seq id no.2所示序列的基础上通过primer定点诱变即可获得。
15、在上述生物材料中，重组表达载体包括质粒载体和病毒载体。
16、本专利技术第三方面提供了上述生物材料在在制备pfu dna聚合酶突变体中的应用，具体为：将测序正确的编码pfu dna聚合酶突变体的基因克隆至表达载体中，再将重组表达载体转化至宿主细胞中，表达后纯化即得。
17、本专利技术第四方面提供了本专利技术所述pfu dna聚合酶突变体在制备逆转录反应试剂或体系中的应用，其中，pfu dna聚合酶突变体优选为e665k/e735k突变体或k118i/n713v突变体。
18、本专利技术所述的pfu dna聚合酶突变体具有逆转录酶活性，故其能以rna为模板，逆转录合成cdna；同时，由于突变体还保留了野生型酶的聚合酶活性，故相较于常规逆转录酶较低的保真性，本专利技术突变体本身的校准活性使其具备高保真性。
19、优选地，在上述逆转录反应体系中，还包括pcr反应液。
20、本专利技术第五方面提供了本专利技术所述pfu dna聚合酶突变体在rt-pcr反应或rna检测中的应用，具体为：以rna为模板，使用本专利技术所述的pfu dna聚合酶突变体逆转录合成cdna并扩增该cdna。
21、在上述应用中，所述pfu dna聚合酶突变体优选为k118i/n713v突变体；实验数据表明，该突变体在56-74℃的温度范围内均有逆转录活性，其中68℃为最佳。
22、本专利技术的pfu dna聚合酶突变体不仅有催化5’→3’的dna聚合活性以及3’→5’的校正活性，且同时具备逆转录活性，加之高耐热性，使其能够以rna为底物高效、高保真地生成cdna，继而在标准pcr反应条件下扩增该cdna，全过程无需额外添加逆转录酶，实现单酶“一步法”rt-pcr。
23、本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有逆转录酶活性的Pfu DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Pfu DNA聚合酶突变体为以下任一：
2.一种编码权利要求1所述Pfu DNA聚合酶突变体的基因。
3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。
4.含有权利要求2所述基因或权利要求3所述重组表达载体的重组细胞。
5.权利要求2所述基因或权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述重组细胞在制备Pfu DNA聚合酶突变体中的应用。
6.权利要求1所述的Pfu DNA聚合酶突变体在制备逆转录反应试剂或体系中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述Pfu DNA聚合酶突变体为E665K/E735K突变体或K118I/N713V突变体。
8.权利要求1所述的Pfu DNA聚合酶突变体在RT-PCR反应或RNA检测中的应用，具体为：以RNA为模板，使用权利要求1所述的Pfu DNA聚合酶突变体逆转录合成cDNA并扩增该cDNA。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述Pfu DNA聚合酶突变体为K118
10.一种基于RT-qPCR检测RNA的方法，其特征在于，所述方法不以疾病诊断和治疗为目的，所述方法具体为：以待测RNA为模板，利用权利要求1所述的Pfu DNA聚合酶突变体进行实时荧光定量PCR，通过荧光结果对待测RNA进行定性或定量分析。
...【技术特征摘要】
1.一种具有逆转录酶活性的pfu dna聚合酶突变体，其特征在于，所述pfu dna聚合酶突变体为以下任一：
2.一种编码权利要求1所述pfu dna聚合酶突变体的基因。
3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。
4.含有权利要求2所述基因或权利要求3所述重组表达载体的重组细胞。
5.权利要求2所述基因或权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述重组细胞在制备pfu dna聚合酶突变体中的应用。
6.权利要求1所述的pfu dna聚合酶突变体在制备逆转录反应试剂或体系中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述pfu dna聚合酶突变体为e665k/e735k...
【专利技术属性】
技术研发人员：马立新，陈晚苹，韩瑞，王飞，何念祖，崔佳凯，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：
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