【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子诊断，具体涉及内含埃博拉病毒n蛋白的盔甲rna的标准物质及其制备方法。
技术介绍
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3、埃博拉病毒是高度危险的病原体，必须在专门的实验设施内进行病毒的分离与鉴定。在非洲疫区主要通过检测埃博拉病毒的特异性igm和igg抗体以及检查病毒抗原或核酸等进行诊断。
4、核酸检测以实时荧光定量pcr作为主要的检测手段，其具有快速，灵敏度高，特异性强的特点，并且用射线照射标本并灭活病毒后，再检测病毒rna时，实验安全性增高，且实验结果也不受显著影响。核酸检测中需要有阳性质控品作为参考以排除检测试剂的各个组分是否存在问题，大部分实验室使用的是质粒或者rna作为标准品，但是质粒或者rna等核酸存在稳定性差，且不能很好的模拟埃博拉病毒的结构，以排除核酸检测中核酸提取这一步是否存在问题，而盔甲rna是一类内部含有所需检测病毒rna片段的蛋白颗粒，外层蛋白的存在对其内部的rna片段起到了保护作用，使之能抵抗环境中酶的降解，同时其整体结构又很好模拟了病毒核酸天然存在的特征，因而是一种十分理想的pcr诊断试剂质控/标准品。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供内含埃博拉病毒n蛋白的盔甲rna的标准物质，提供一种能够保护被检测病毒rna片段的蛋白颗粒，解决现有质粒或rna等核酸稳定性差的问题，目的之二在于提供内含埃博拉病毒n蛋白的盔甲rna的标准物质的制备方法。
2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
3、
4、内含埃博拉病毒n蛋白的盔甲rna的标准物质的制备方法，包括如下步骤：
5、步骤一：从ncbi网站中获取埃博拉病毒l蛋白的序列，然后进行基因合成并引入同源重组臂，获得最终基因合成的埃博拉病毒l蛋白序列，如seq id no2所示；
6、步骤二：将盔甲rna的载体pet-28b-rna载体使用hind iii进行酶切线性化之后并进行胶回收，得到线性化盔甲rna载体，将基因合成的埃博拉病毒l蛋白序列采用l蛋白引物pcr扩增后，以无缝克隆的方式构建到盔甲rna质粒中，得到含有埃博拉病毒l蛋白核酸序列的盔甲rna质粒；
7、步骤三：含有埃博拉病毒l蛋白核酸序列的盔甲rna质粒转化bl21感受态细胞并进行诱导表达及纯化,得到高纯度的内含埃博拉病毒l蛋白的盔甲rna的标准物质。
8、进一步地，步骤三中诱导表达及纯化的具体步骤为：挑取单克隆的bl21感受态细胞，37℃培养至od600值在0.5-0.7之间，加入iptg至终浓度为0.5mm，25℃诱导表达14h收集菌体，采用超声波破碎，在4℃和11000r/min的条件下离心20min收集上清并分别加入终浓度为80u/ml的dnase i和终浓度为12μg/ml的rnase a进行消化，用0.45μm的滤膜过滤后进行氯化铯密度梯度离心，在4℃和80000r/min的条件下离心5h，吸取含埃博拉病毒l蛋白的盔甲rna的目标层液体，通过sephacryi s-200hr层析柱进行纯化。
9、本专利技术的有益效果：
10、本专利技术内含埃博拉病毒n蛋白的盔甲rna的标准物质可以用作埃博拉病毒感染诊断中核酸检测技术中的阳性质控参照品，通过相应制备方法获取的内含埃博拉病毒n蛋白的盔甲rna的标准物质经过标定，其拷贝数为3.5e+10copies/ml，最终制得的埃博拉病毒rna标准品稳定性好、纯度高，相比常规的核酸检测中的rna核酸检测阳性标准品而言，可以更好的模拟埃博拉病毒的野生型形态和核酸检测过程中必不可少的核酸提取环节，为埃博拉病毒的快速准确的检测提供核酸检测的阳性质控标准品。
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1.内含埃博拉病毒N蛋白的盔甲RNA的标准物质，其特征在于，应用于埃博拉病毒感染诊断中核酸检测技术中的阳性质控参照品。
2.根据权利要求1所述的内含埃博拉病毒N蛋白的盔甲RNA的标准物质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的内含埃博拉病毒N蛋白的盔甲RNA的标准物质的制备方法，其特征在于，基因合成的埃博拉病毒L蛋白序列如SEQ ID NO2所示。
4.根据权利要求1所述的内含埃博拉病毒N蛋白的盔甲RNA的标准物质的制备方法，其特征在于，步骤三中诱导表达及纯化的具体步骤为：挑取单克隆的BL21感受态细胞，37℃培养至OD600值为0.5-0.7，加入IPTG至终浓度为0.5Mm，25℃诱导表达14h收集菌体，超声波破碎，4℃和11000r/min离心20min，收集上清并分别加入终浓度为80U/mL的DNase I和终浓度为12μg/mL的RNase A进行消化，过滤，离心，吸取含埃博拉病毒L蛋白的盔甲RNA的目标层液体，通过Sephacry I S-200HR层析柱进行纯化。
5.根据权利要求1所述的内含埃
6.根据权利要求5所述的内含埃博拉病毒N蛋白的盔甲RNA的标准物质的制备方法，其特征在于，L蛋白-FP的序列如下：
7.根据权利要求5所述的内含埃博拉病毒N蛋白的盔甲RNA的标准物质的制备方法，其特征在于，L蛋白-RP的序列如下：
...【技术特征摘要】
1.内含埃博拉病毒n蛋白的盔甲rna的标准物质，其特征在于，应用于埃博拉病毒感染诊断中核酸检测技术中的阳性质控参照品。
2.根据权利要求1所述的内含埃博拉病毒n蛋白的盔甲rna的标准物质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的内含埃博拉病毒n蛋白的盔甲rna的标准物质的制备方法，其特征在于，基因合成的埃博拉病毒l蛋白序列如seq id no2所示。
4.根据权利要求1所述的内含埃博拉病毒n蛋白的盔甲rna的标准物质的制备方法，其特征在于，步骤三中诱导表达及纯化的具体步骤为：挑取单克隆的bl21感受态细胞，37℃培养至od600值为0.5-0.7，加入iptg至终浓度为0.5mm，25℃诱导表达14h收集菌体，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘登辉，周华香，周金山，张万昌，
申请(专利权)人：通用生物安徽股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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