一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。该试剂盒包含副结核分支杆菌重组ｈｅｄ蛋白，羊驼副结核阳性对照血清、阴性对照血清，还可以包括酶标板、包被液、封闭液、ＰＢＳＴ、辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白Ａ（ＨＲＰ－ＳＰＡ）、显色液配制原料和终止液。由于本发明专利技术试剂盒，引入了特异性强、且高效表达的副结核分支杆菌ｈｅｄ蛋白，用它作为检测抗原，直接检测羊驼抗副结核分支杆菌抗体，具有良好的特异性和灵敏度。用本试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体方法简便、快速且准确，适合大批量样品检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及羊驼副结核分支杆菌(Mycobacterium paratuberculosis, MAP)的 hed(Host expression dependent)蛋白间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，属于生物技 术领域。
技术介绍
羊驼原产于南美洲安第斯山脉，与驼羊、骆马、原驼共同属于美洲驼属，被称为南 美小型驼。驼绒有22种天然色，是高级毛纺原料，具有“软黄金”之称；其皮可制成地毯、 被子等；其肉蛋白质含量高，味道鲜美。羊驼是一种很有市场前景的经济动物，我国山西于 2000年首次从澳大利亚引进羊驼，随后在新疆维吾尔自治区等地区也先后引进羊驼，为我 国农牧民增收增添了新的亮点。羊驼副结核病是由副结核分支杆菌(Mycobacterium paratuberculosis, MAP)引 起的羊驼的一种慢性传染性肠炎，羊驼价格昂贵，一旦羊驼牧场被大面积传染该病，造成的 经济损失将是巨大的。副结核病的检测常采用皮内变态反应、补体结合试验等，但是皮内变 态反应需要检测活动物，且灵敏度较低；补体结合试验灵敏度较低，且检测很不方便。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供， 该检测方法特异性高，灵敏度高，方便，快速，适合大规模样品检测。本专利技术提供一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，包含下列试剂(1)、副结核分支杆菌重组hed蛋白；(2)、羊驼副结核阳性对照血清、阴性对照血清。所述试剂盒还可以包含酶标板、包被液、封闭液、PBST、辣根过氧化物酶标记的金 黄色葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA)、显色液配制原料和终止液；所述包被液是浓度为lmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 7. 5 ；所述封闭液是质量浓度为2%的明胶溶液；所述PBST 的组成是=Na2HPO4 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L, NaCl 8. 0g/L, KCl 0. 2g/L, Tween-20体积浓度为0. 05%，其pH为7. 4 ；所述显色液配制原料包括①由Na2HPO4 ·12Η20 18. 408g/L，柠檬酸5. 106g/L组成 的磷酸盐_柠檬酸盐缓冲液，PH 5. 0 ；②邻苯二胺；③体积浓度为30%的H2O2水溶液；所述终止液是浓度为2mol/L的H2SO4溶液。本专利技术还提供采用上述试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体的方法，按如下步 骤(1)、包被副结核分支杆菌重组hed蛋白用包被液稀释至3. 75 μ g/mL,于酶标板 各孔中分别加入100 μ L，4°C包被过夜，用PBST洗涤5次；(2)、封闭每孔加入300 μ L封闭液，4°C封闭过夜，用PBST洗涤5次；(3)、加入待检样品以PBST分别将阳性对照血清、阴性对照血清、待检血清按体 积1 50稀释，每孔中加入100yL，37°C孵育60min，用PBST洗涤5次；(4)、加入辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A 用PBST将辣根过氧化物 酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A作1 5000稀释，每孔中加入100yL，37°C孵育60min，用 PBST洗涤5次；(5)、配制并加入显色液临显色之前向所述磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中加入邻苯 二胺，使邻苯二胺浓度达到0. 4g/L，然后加入所述的H2O2水溶液0. 15mL,即获得显色液；每 孔加入该显色液100μ L，37°C避光孵育15min ；(6)、终止每孔加入100 μ L终止液终止反应，酶标仪测定每孔的OD49tlnm值；(7)、判定待检血清孔的OD49tlnm值彡阴性对照血清孔的OD49tlnm值+0. 24，判为阳性； 反之判为阴性。本专利技术提供的检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，引入了特异性强、且高效 表达的副结核分支杆菌hed蛋白，用它作为检测抗原，直接检测羊驼抗副结核分支杆菌抗 体，具有良好的特异性和灵敏度。用本试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体方法简便、快速 且准确，适合大批量样品检测。具体实施例方式实施例1副结核分支杆菌重组hed蛋白的制备1.引物设计从GenBank上调取MAP的基因序列(X16293)，用DNAStar软件分析 hed (Host expression d印endent)基因的抗原性，选取抗原性较好的840bp片断作 为扩增目的基因，上游引物Pl :5，-ATAGGATCCGGTAGTTACCGCGGCGAA-3’，下游引物P2 5’ -CGCAAGCTTTTAGGTGTGGCGTT TTC-3，，限制性内切酶位点为 BamH I 和 Hind III。2. hed基因的扩增、克隆提取副结核分支杆菌K-IO的基因组DNA，进行PCR扩增，采用50 μ L体系体积 IOXEx Taq Buffer 5 μ L, dNTPs (IOmM) 4 μ L，Mg2+(25mM) 4 μ L，TaKaRaEx Taq 酶(5U/ μ L)0. 3 μ L，上游引物 Pl (20pmol/L) 1 μ L，下游引物 P2(20pmol/L) 1 μ L，超纯水 32. 7 μ L， 模板DNA2y L。反应程序为:94°C预变性 5min，94°C 45s, 57°C 45s, 72°C 45s，35 个循环；72°C 延伸lOmin。扩增产物电泳、回收后，克隆至pGEM-T，获得重组质粒pGEM-T-hed。按照碱裂解 法提取重组质粒，BamH I和Hind III双酶切后电泳，回收大小为840bp的特异性目的片段， 与重组载体pET-32a(+)用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)按照说明书的条件进行连接，按照 常规方法转化到感受态细胞E. coli BL21(DE3)中，筛选到阳性表达质粒(pET-32a-hed)。 对表达质粒pET-32a-hed进行PCR扩增、BamH I和Hind III双酶切，电泳后在大小约为 840bp处均出现特异性条带。对表达质粒pET-32a-hed进行测序，结果经DNAStar软件分析 发现，PCR扩增片段与X16293序列同源性为99. 5%，推导的氨基酸序列与已报道的氨基酸 序列相同。3.副结核分支杆菌重组hed蛋白的表达及纯化将含有表达质粒pET-32a_hed的E. coli BL21 (DE3)于LB培养基中培养至对数生 长期(OD6tltlmin为0. 6-0. 8)，加入IPTG至浓度为0. 8mM,诱导4h后离心，菌体沉淀用PBS缓冲液重悬，超声裂解后离心，沉淀用6M的尿素溶液溶解，离心，上清用0. 45 μ m微孔滤膜过滤 后，用His Bind Purification Kit (Novagen公司)按照说明书的方法纯化副结核分支杆 菌重组hed蛋白。纯化的重组蛋白用SDS-PAGE电泳分析，观察到约49. 5kD的特异性蛋白 条带，大小与预计相似，说明纯化的副结核分支杆菌重组hed蛋白的纯度较好。实施例2鉴定副结核分支杆菌重组hed蛋白的反应原性和免疫原性1.免疫转印将实施例1纯化的重组hed蛋白经SDS-PAGE电泳后，凝胶用半干转印仪 (Bio-Rad)电转印至PVNF膜(Osmonics公司)。将转印后的PVNF膜用1% (m/v)牛血清 白蛋白封闭，加入1 100稀释的羊抗副结核阳性血清(中国兽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，包含下列试剂：（１）副结核分支杆菌重组ｈｅｄ蛋白；（２）羊驼副结核阳性对照血清、阴性对照血清。

【技术特征摘要】
一种检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，包含下列试剂(1)副结核分支杆菌重组hed蛋白；(2)羊驼副结核阳性对照血清、阴性对照血清。2.根据权利要求1所述的检测羊驼副结核分支杆菌抗体的试剂盒，其特征在于还包含 酶标板、包被液、封闭液、PBST、辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌蛋白A、显色液配制 原料和终止液；所述包被液是浓度为lmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 7. 5 ；所述封闭液是质量浓度为2%的明胶溶液；所述 PBST 的组成是=Na2HPO4 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L, NaCl 8. Og/L, KCl 0. 2g/L, Tween-20体积浓度为0. 05%，其pH为7. 4 ；所述显色液配制原料包括①由Na2HPO4 · 12H20 18. 408g/L,柠檬酸5. 106g/L组成的磷 酸盐_柠檬酸盐缓冲液，PH 5. 0 ；②邻苯二胺；③体积浓度为30%的H2O2水溶液；所述终止液是浓度为2mol/L的H2SO4溶液。3.一种采用权利要求2的试剂盒检测羊驼副结核分支杆菌抗体的方法，按如下步骤(1)、包被副结核分支杆菌重组h...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐泰山，廉慧锋，张常印，王凯民，姜焱，祝长青，张睿，
申请(专利权)人：江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]