【技术实现步骤摘要】
本申请涉及细胞培养，特别是涉及一种目的蛋白的生产方法和稳转细胞株的优化方法。
技术介绍
1、细胞培养是生产目的蛋白的重要方法之一，被广泛用于医药研究、生物技术和制药工业中。通常流程为，先选择合适的宿主细胞，然后将目标基因导入到宿主细胞内，获得能够稳定表达目标基因的细胞株，也即稳转细胞株；随后，再对稳转细胞株给与适合的培养基和生长条件进行细胞培养；培养一段时间后，可以通过收获和提取等步骤来获得细胞所生产的目的蛋白，再经一些蛋白纯化和提纯的后续步骤，以获得纯度较高的目的蛋白。
2、目前，生产目的蛋白通常是对细胞采用流加培养的方式。随着培养时间的增加，在流加培养的后期，代谢废物积累得越来越多，仅仅靠营养物质的增加已经不能维持细胞的生长，因此细胞的活率会逐渐下降。这一过程不仅使细胞的生长代谢降低，产出的大分子药物变少，生产效率下降，也伴随着更多的细胞碎片和hcp(宿主细胞蛋白)的产生，这些成分也会影响后期目的蛋白纯化难度和目的蛋白的质量。
3、现有技术中针对上述问题，通常是对培养工艺例如培养基组分、补糖、补料、溶氧、ph、转速等条件进行调整，也即是在原稳转细胞株的基础上对培养工艺进行优化，然而，受限于原有稳转细胞株的特性，流加培养后期的细胞活率的维持可优化空间仍然有限。
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种改善培养后期细胞活率下降问题的方法。
2、本申请采用了以下技术方案：
3、本申请的一方面公开了一种目的蛋白的生产方法，包括：获得稳转细
4、需要说明的是，稳转细胞株指经过基因转染或遗传工程技术处理后，在细胞中稳定表达外源基因的细胞系。本申请的目的蛋白的生产方法，通过对稳转细胞株作筛选处理，在预培养至细胞活率下降至一定程度时，取出进行传代培养，使存活的细胞进行传代，由此，能够筛选得到在预培养中对代谢废物更加耐受的、有利于在培养后期存活的细胞，很可能去除了部分具有相应不利突变或富集了获得了相应有利突变的细胞，通过传代培养，能够进一步富集所筛选得到的细胞，本申请能够从细胞自身来提升在培养后期维持活率的能力。
5、还需要说明的是，在预培养至细胞活率下降至一定程度后进行传代培养，细胞活率下降的较少，则筛选的作用有限，细胞活性下降的过多，则可能导致无法通过传代培养使细胞活率恢复，本申请通过合理的试验(在预培养时对细胞活率进行监测，在预培养的多个活率的时刻点将细胞进行冻存结束预培养，对传代培养的效果、生产培养的细胞活率进行记录)得出，预培养至细胞活率下降至60％至80％较为合适。
6、还需要说明的是，传代培养是细胞培养中的一项常见操作，用于维持和扩增细胞系。在传代培养过程中，细胞从一个培养容器中移植到新的培养容器中，同时加入新的培养基供细胞继续生长和繁殖。本申请中，通过传代培养至细胞活率达到95％及以上则可认为细胞活率已经恢复。
7、本申请的一种实现方式中，所述稳转细胞株的细胞类型为cho细胞、hek293细胞、sf9细胞、ns0细胞和bhk-21细胞的其中一种。
8、本申请的一种实现方式中，所述目的蛋白为单克隆抗体、双特异性抗体、非fc融合蛋白、fc融合蛋白、重组蛋白、病毒载体和疫苗的其中一种。
9、本申请的一种实现方式中，所述筛选处理的次数为2至4次。
10、需要说明的是，筛选次数为2是指，传代培养直至细胞活率达到95％或95％以上后，继续预培养至细胞活率下降到60％至80％时，结束培养，并进行第二次传代培养，直至细胞活率达到95％或95％以上。筛选次数为3是指，第二次传代培养直至细胞活率达到95％或95％以上后，继续预培养至细胞活率下降到60％至80％时，结束培养，并进行第三次传代培养，直至细胞活率达到95％或95％以上。以此类推。
11、需要说明的是，虽然从理论上来说，筛选处理的次数越多，能够富集得到更高比例的对代谢废物更加耐受、有利于在培养后期存活的细胞，但是，筛选次数达到一定数量后，其效果会到达一个平台期，也即其效果增加的会比较有限，且对稳转细胞株进行筛选处理需要耗费时间，如果筛选次数较多，会增加时间、人力等一系列成本，进而会无法满足生产工期和生产效率的要求。
12、本申请的一种实现方式中，对所述稳转细胞株进行预培养，待培养至细胞活率下降至70％时，结束所述预培养。在这种情况下，能够具有较佳的筛选效果和较佳的活率恢复效果。
13、本申请的一种实现方式中，所述预培养时的接种密度为3×105至5×105cells/ml。
14、本申请的一种实现方式中，所述传代培养时的接种密度为3×105至5×105cells/ml。
15、本申请的一种实现方式中，所述预培养为流加培养。在这种情况下，由于通过流加培养的方式代谢产物会一直积累，能够有助于通过预培养来筛选对代谢产物耐受的细胞。
16、本申请的一种实现方式中，所述生产培养为流加培养。
17、本申请的另一方面公开了一种稳转细胞株的优化方法，包括：对所述稳转细胞株进行预培养，待培养至细胞活率下降至60％至80％时，结束所述预培养，并进行传代培养，直至细胞活率达到95％或95％以上。
18、需要说明的是，本申请的稳转细胞株的优化方法，通过对稳转细胞株作筛选处理，在预培养至细胞活率下降至一定程度时，取出进行传代培养，使存活的细胞进行传代，由此，能够筛选得到对代谢废物更加耐受的、有利于在培养后期存活的细胞，很可能去除了部分具有相应不利突变或富集了获得了相应有利突变的细胞，能够对稳转细胞株进行优化，有利于提升后续进行细胞培养时在培养后期维持活率的能力。可以理解，本申请的稳转细胞株的优化方法，同样优选进行2至4次的筛选处理。
19、本申请的有益效果在于：
20、能够通过筛选处理得到对代谢废物更加耐受的细胞，进而能够从细胞自身来提升在培养后期维持活率的能力。
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1.一种目的蛋白的生产方法，其特征在于，包括：获得稳转细胞株后，对所述稳转细胞株进行一次或多次的筛选处理，再将一次或多次筛选处理后的稳转细胞株进行生产培养以生产所述目的蛋白；
2.根据权利要求1所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，所述稳转细胞株的细胞类型为CHO细胞、HEK293细胞、SF9细胞、NS0细胞和BHK-21细胞的其中一种。
3.根据权利要求2所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，所述目的蛋白为单克隆抗体、双特异性抗体、非Fc融合蛋白、Fc融合蛋白、重组蛋白、病毒载体和疫苗的其中一种。
4.根据权利要求1所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，所述筛选处理的次数为2至4次。
5.根据权利要求1所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，对所述稳转细胞株进行预培养，待培养至细胞活率下降至70%时，结束所述预培养。
6.根据权利要求1所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，所述预培养时的接种密度为3×105至5×105cells/mL。
7.根据权利要求6所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，所述传代培养时的
8.根据权利要求1所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，所述预培养为流加培养。
9.根据权利要求1所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，所述生产培养为流加培养。
10.一种稳转细胞株的优化方法，其特征在于，包括：对所述稳转细胞株进行预培养，待培养至细胞活率下降至60%至80%时，结束所述预培养，并进行传代培养，直至细胞活率达到95%或95%以上。
...【技术特征摘要】
1.一种目的蛋白的生产方法，其特征在于，包括：获得稳转细胞株后，对所述稳转细胞株进行一次或多次的筛选处理，再将一次或多次筛选处理后的稳转细胞株进行生产培养以生产所述目的蛋白；
2.根据权利要求1所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，所述稳转细胞株的细胞类型为cho细胞、hek293细胞、sf9细胞、ns0细胞和bhk-21细胞的其中一种。
3.根据权利要求2所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，所述目的蛋白为单克隆抗体、双特异性抗体、非fc融合蛋白、fc融合蛋白、重组蛋白、病毒载体和疫苗的其中一种。
4.根据权利要求1所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，所述筛选处理的次数为2至4次。
5.根据权利要求1所述的目的蛋白的生产方法，其特征在于，对所述稳转细胞株进...
【专利技术属性】
技术研发人员：张倩，夏晚霞，蓝天翌，唐丽莲，梁献平，
申请(专利权)人：深圳市乐土生命科技投资有限公司，
类型：发明
国别省市：
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