本发明专利技术公开了一种从生物转化液中分离纯化２′－脱氧腺苷的方法。该方法，是将制得的生物转化液离心除去菌体，得到上清液，上清液经过离子交换树脂柱吸附，吸附完毕后，先用Ｎａ２ＣＯ３水溶液洗脱，再用有机溶剂的混合液洗脱，用乙醇结晶后得到２′－脱氧腺苷。该方法将生物转化液中的２′－脱氧腺苷与其它杂质分离和提取出来，产品纯度达９９％以上；而且提高了分离和提取速度，降低了成本、减少环境污染，具有重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术于生物医药
，涉及一种从生物转化液中分离纯化2'-脱氧腺苷 的方法
技术介绍
2'-脱氧腺苷是脱氧核糖核酸DNA的结构片段，是基因药物和基因工程研究的 重要原材料，具有很好的生理活性，虽未有报道其可直接用于抗病毒，但是可作为一种重要 的原料，经过化学结构改造得到的2 ‘-脱氧腺苷类似物具有良好的抗肿瘤活性，因此在市 场上有广泛需求。2'-脱氧腺苷可通过脱氧核糖核酸的降解而得到，但是由于降解后产 物分离困难等原因，使得该方法并不实用。脱氧腺苷也可通过化学合成法合成，但其步骤过 于复杂，比如一些基团的保护与去保护以及糖基的活化等。图1是一种化学合成方法，以 3飞二苯甲酰基腺苷为原料和N，N-二甲基苯甲酰胺及碳酰氯反应，再与硫化氢及吡啶反 应，然后经三正丁基锡化氢脱氧，最后经甲醇氨脱保护得到脱氧腺苷。上述化学法生产2 ‘-脱氧腺苷有以下缺点1、其原料1-氯-3，5_ 二对硝基 苯-2-脱氧核糖不易得到，需要自己生产；2、产率较低(约26%)，难以实现工业化生产；3、 是使用汞盐，不利于环保与工人健康；4、得到的产物为α，β混合物，后期纯化困难，产品 纯度低。通过生物转化法合成2'-脱氧腺苷的方法(见图2所示)，具有步骤简单，反应 时间短等优点，避免了以上不足。目前，国内外文献对提高转化产率的研究较多，但对提取 纯化工艺的研究却相对较少。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种分离纯化2 ‘-脱氧腺苷的方法。本专利技术提供的分离纯化2'-脱氧腺苷的方法，包括如下步骤1)生物转化液预处理将生物转化液离心，取上清液，置于0_25°C冰箱中保存，得到预处理完毕的所述生 物转化液；2)样品吸附及2'-脱氧腺苷的解析将pH值调节至5-8的所述预处理完毕的生物转化液上样于所述层析柱中，依次用 碳酸钠水溶液和乙醇水溶液进行洗脱，收集用所述乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液；所述层析柱中的介质为离子交换树脂或大孔吸附树脂；3)结晶将所述步骤2)得到的洗脱液中加入无水乙醇，于0-25°C结晶后得到2' _脱氧腺 苷晶体粗品，将所述2' _脱氧腺苷晶体粗品用乙醇水溶液进行重结晶，得到所述2'-脱 氧腺苷。上述方法的步骤1)中，所述生物转化液是按照如下方法所得以2'-脱氧胸苷为核糖基供体，腺嘌呤为碱基供体，通过微生物发酵产生的核糖磷酸化酶进行生物 转化，得到所述生物转化液。制备所述生物转化液步骤中，所述微生物为瑞士乳杆菌 (Lactobacillus helveticus)，所述瑞士乳杆菌的保藏编号CGMCC 1. 1877(中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)；所述离心步骤中，温度为0-25°C，优选4°C， 时间为10-60分钟，优选20分钟，转速为3000-8000rpm，具体可为3500rpm、5000rpm或 3500-5000rpm,优选 4000rpm,离心半径为 150_400mm，优选 200mm。所述步骤2)中，所述离子交换树脂优选为阴离子型树脂。各种常用的由公开商 业途径购买所得阴离子交换树脂均适用，如717型阴离子型树脂、D201型阴离子型树脂或 D290型阴离子型树脂，优选717型阴离子型树脂；各种常用的由公开商业途径购买所得大 孔吸附树脂均适用，如DlOl型大孔吸附树脂、DM18型大孔吸附树脂、HPD722型大孔吸附树 脂或AB-8型大孔吸附树脂，优选DlOl型大孔吸附树脂。所述层析柱中的介质在使用前进 行如下预处理将所述层析柱中的介质先用乙醇水溶液浸泡后，用去离 子水洗涤后用氢氧 化钠水溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性后用盐酸水溶液浸泡，最后用去离子水洗涤至 中性；所述乙醇水溶液的体积百分浓度为75-99.9%，优选95%，所述氢氧化钠水溶液的浓 度为0. 5-2. Omo 1/L,优选lmol/L，所述盐酸水溶液的浓度为0. 5-2. Omo 1/L,优选lmol/L。所 述用乙醇水溶液浸泡步骤中，时间为12-36小时，优选24小时；所述用氢氧化钠水溶液浸泡 步骤中，时间为2-8小时，优选4小时；所述用盐酸水溶液浸泡步骤中，时间为2-8小时，优 选4小时。所述步骤2)洗脱步骤中，所述碳酸钠水溶液的浓度为0. 05M-0. 2M，具体为 0. 1-0. 15M，优选0. 1M，所述乙醇水溶液的体积百分浓度为30-75%，具体为45-55 %，优选 45%。所述用碳酸钠水溶液进行洗脱步骤中，所述碳酸钠水溶液的用量为所述分离纯化 2 ‘-脱氧腺苷用层析柱的柱体积的2-10倍，具体为2-6倍、2倍或6倍，优选4倍，洗脱 次数为1次；所述用乙醇水溶液进行洗脱步骤中，所述乙醇水溶液的用量为所述分离纯化 2'-脱氧腺苷用层析柱的柱体积的1-5倍，具体为3-4倍，优选3倍，洗脱次数为1次。该 步骤中，用碳酸钠水溶液洗脱的目的是去除层析柱中蛋白等杂质。洗脱速率为洗脱液由层 析柱顶端依靠重力自然流出的速率，不需额外人为设定洗脱速率。所述步骤3)所述加入无水乙醇步骤中，无水乙醇的用量为所述步骤2)得到的洗 脱液体积的0. 2-2倍，优选0. 5倍；所述2'-脱氧腺苷晶体粗品用乙醇水溶液进行重结 晶步骤中，所述乙醇水溶液的体积百分浓度为10-50%，具体为20%、30%或20-30%，优选 45%，所述乙醇水溶液的用量为所述2'-脱氧腺苷粗品体积的0. 2-2倍，具体为0. 4倍、2 倍或0. 4-2倍，优选0.4倍。上述方法的步骤1)中，所述生物转化液具体可按照包括如下步骤的方法制备而 得将瑞士乳杆菌接入发酵培养基中发酵培养，得到菌体，将所述菌体破碎，制成细胞破碎 液，向所述细胞破碎液中加入2'-脱氧胸苷和腺嘌呤进行酶促反应，获得所述2'-脱氧 腺苷；所述腺嘌呤的直径小于等于10 μ m ；各种能够发酵培养瑞士乳杆菌的培养基均适用，如可用由下列重量份的物质组成 的培养基葡萄糖10-20、蛋白胨1-5、玉米麸质粉10-25、柠檬酸胺1_2、磷酸氢二钾1_2、 硫酸钠5-10、硫酸锰0. 02-0. 4和水1000 ；所述发酵培养的温度为30-42°C，搅拌转速为 120-160转/分钟，pH值为6. 0-7. 5，发酵时间为24-36小时；所述瑞士乳杆菌种子液与所述发酵培养基的体积比可为10% -15% ；所述瑞士乳杆菌种子液是按照如下方法获得将瑞士乳杆菌接种到斜面培养基 培养制成斜面菌种，将所述斜面菌种接入发酵培养基中培养获得种子液；各种能够培养 获得种子液的斜面培养基均适用，如所述斜面培养基可为由下列重量份的物质组成葡 萄糖10-20、蛋白胨10-20、酵母膏3-8、柠檬酸胺1_2、磷酸氢二钾1_2、硫酸钠5_10、硫 酸锰0. 02-0. 4，琼脂15-20和水1000 ；所述瑞士乳杆菌接种到斜面培养基培养的温度为 30-42 0C，pH 值为 6. 5-8. 0，培养 24-48 小时；对菌体进行破碎的目的是为了释放菌体内的核糖磷酸化酶，所述细胞破碎液按照 如下方法制备将所述粗菌体用柠檬酸缓冲液洗涤，然后用PH值为6. 0-7. 0磷酸缓冲液悬 浮，获得细胞悬浮液，超声破碎所述细胞悬浮液，获得细胞破碎液；所述柠檬酸缓冲液的PH 值为6. 0-7. 0 ；所述磷酸缓冲液的pH值为6. 0 ；所述超本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离纯化２′－脱氧腺苷的方法，包括如下步骤： １）将生物转化液离心，取上清液，置于０－２５℃冰箱中保存，得到预处理完毕的所述生物转化液； ２）将ｐＨ值调节至５－８的所述预处理完毕的生物转化液上样于所述层析柱中，依次用碳酸钠水溶液和乙醇水溶液进行洗脱，收集用所述乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液； 所述层析柱中的介质为离子交换树脂或大孔吸附树脂； ３）将所述步骤２）得到的洗脱液中加入无水乙醇，于０－２５℃结晶后得到２′－脱氧腺苷晶体粗品，将所述２′－脱氧腺苷晶体粗品用乙醇水溶液进行重结晶，得到所述２′－脱氧腺苷。
【技术特征摘要】
一种分离纯化2′ 脱氧腺苷的方法，包括如下步骤1)将生物转化液离心，取上清液，置于0 25℃冰箱中保存，得到预处理完毕的所述生物转化液；2)将pH值调节至5 8的所述预处理完毕的生物转化液上样于所述层析柱中，依次用碳酸钠水溶液和乙醇水溶液进行洗脱，收集用所述乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液；所述层析柱中的介质为离子交换树脂或大孔吸附树脂；3)将所述步骤2)得到的洗脱液中加入无水乙醇，于0 25℃结晶后得到2′ 脱氧腺苷晶体粗品，将所述2′ 脱氧腺苷晶体粗品用乙醇水溶液进行重结晶，得到所述2′ 脱氧腺苷。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)离心步骤中，温度为0-25°C， 优选4°C，时间为10-60分钟，优选20分钟，转速为3000-8000rpm，优选4000rpm，离心半径 为 150-400mm，优选 200mm ；所述生物转化液是按照如下方法制备而得以2' _脱氧胸苷为核糖基供体，腺嘌呤为 碱基供体，通过微生物发酵产生的核糖磷酸化酶进行生物转化，得到所述生物转化液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，制备所述生物转化液步 骤中，所述微生物为瑞士乳杆菌。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，所述离子交换树 脂为阴离子树脂；所述阴离子交换树脂为717型阴离子树脂、D201型阴离子树脂或D290型 阴离子树脂，优选717型阴离子树脂；所述大孔吸附树脂为DlOl型大孔吸附树脂、DM18型大孔吸附树脂、HPD722型大孔吸附 树脂或AB-8型大孔吸附树脂，优选DlOl型大孔吸附树脂。5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，所述层析柱中的 介质在使用前进行如下预处理将所述层析柱中的介质先用乙醇水溶液浸泡后，用去离子 水洗涤后用氢氧化钠水溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性后用盐酸水溶液浸泡，最后用 去离子水洗涤至中性；所...
【专利技术属性】
技术研发人员：王洪钟，张荣庆，谢丽萍，张文权，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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