【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种微生物发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法。
技术介绍
1、l-异亮氨酸属于必需氨基酸，分支链氨基酸的一种，参与调节生物的新陈代谢过程，是组成蛋白质的重要基质，并被广泛应用于医药，食品，牲畜饲料领域。l-异亮氨酸可以在葡萄糖的协作下促进机体胰岛素的分泌，降低血糖，除此之外l-异亮氨酸可用于制备口服液，达到治疗肥胖症，肝硬化等疾病；在食品领域，作为一种添加剂，l-异亮氨酸能有效防止肌肉损伤，提高个体耐力；在饲料领域，添加适量的l-异亮氨酸可以改善牲畜的回肠屏障功能，预防腹泻等疾病；通过在饲料中适当的添加l-异亮氨酸可提高饲料的营养价值和利用率，使牲畜生长速度加快，降低养殖成本。
2、l-缬氨酸属于支链氨基酸，在工业生产上被广泛应用于制药，食品添加剂饲料，化妆品等领域。医药领域，l-缬氨酸可用于制备注射液，治疗肾衰竭以及血脑功能障碍等疾病。作为食品添加剂的一种，l-缬氨酸可赋予产品缓解疲劳，提高抵抗力的功能。同时，作为饲料添加剂，l-缬氨酸可提高牲畜的泌乳能力及免疫力。在化妆品领域，添加l-缬氨酸可缓解疲劳，保持皮肤湿润并防止角质剥离，增加皮肤弹性与张力。
3、l-异亮氨酸与l-缬氨酸因其特殊的支链结构在生命代谢中占有极为重要的地位,可用于配制复方氨基酸输液包括营养型氨基酸输液、治疗型高支链氨基酸输液及各种口服液制剂，对治疗肝昏迷、肾脏病、肌肉萎缩、皮肤病等症状有显著疗效。
4、目前，异亮氨酸和缬氨酸的工业生产中，微生物发酵法由于具有原材料成本低，反应条件温和
5、专利技术人已公布的专利(cn114410701a)实现了在添加前体物质的情况下，异亮氨酸的高效生产。在部分实施例中提到部分基因工程菌株可以同时积累l-异亮氨酸与l-缬氨酸。但是在该专利中，研究人员重点关注异亮氨酸，缬氨酸被认为是一种副产物，在实施例中，缬氨酸的浓度均较低，整体原料转化率低。
6、由于l-异亮氨酸与l-缬氨酸代谢途径中许多酶是共用的，如二羟酸还原异构酶，二羟酸脱水酶，支链氨基酸转氨酶。通过对发酵体系的合理优化，实现联产l-异亮氨酸与l-缬氨酸，不仅可以提高底物利用率，有效降低生产成本，得到的l-异亮氨酸与l-缬氨酸混合物经简单干燥后可直接用于饲料添加剂或者进一步精制用于制备氨基酸营养液，这对于l-异亮氨酸与l-缬氨酸的工业化生产具有重要意义。
7、申请人经过理论分析和实验研究发现：在发酵前期，提供相对充足的溶氧有助于快速获得可观生物量，同时供应足量苏氨酸和葡萄糖，对异亮氨酸的合成极为有利。但是过高溶氧会导致菌体呼吸旺盛，造成大量碳源被消耗掉，反而不利于异亮氨酸合成。同时，高溶氧会严重抑制l-缬氨酸的合成。因此，为实现两种氨基酸的联产，需要将微生物的生长、异亮氨酸生产与缬氨酸生产三个阶段在合适的时机切换，前期维持相对较高溶氧，一方面使菌体快速启动生长，并进入l-异亮氨酸快速合成，之后适当降低发酵体系的溶氧水平，使得菌体启动生产l-缬氨酸；同时，在发酵过程中灵活调控苏氨酸补料，最终实现两种氨基酸的高效联合生产或特定比例终产品，从而实现了本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术具体提供：
2、一种微生物发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，包括采用微生物进行发酵的步骤，所述发酵包括微生物增殖/异亮氨酸生产阶段和氨基酸联产阶段，发酵结束后从培养物中分离出l-异亮氨酸和l-缬氨酸，其中培养物中l-缬氨酸和l-异亮氨酸的质量比大于或等于20％；其特征在于：
3、1)在发酵过程中加入能转化为2-酮丁酸的原料；
4、2)在氨基酸联产阶段，将溶氧控制在25％以下；
5、3)使用包含乙酰羟酸合成酶基因的微生物进行发酵；优选地，所述乙酰羟酸合成酶为实质上解除了l-异亮氨酸抑制的乙酰羟酸合成酶；优选地，所述实质上解除了l-异亮氨酸抑制的乙酰羟酸合成酶的基因为解除型ilvih基因、解除型ilvbn基因、解除型ilvgm基因、解除型alss基因中的一种或多种。
6、在本专利技术的具体实施方式中，溶氧控制方式包括：调整转速、调整通风量或葡萄糖限制补料或上述方式的联合使用。
7、在本专利技术的具体实施方式中，在微生物增殖/异亮氨酸生产阶段控制溶氧不低于30％。
8、在本专利技术的一个具体实施方式中，菌体生物量od600至20左右时，调整溶氧。
9、在本专利技术的一个具体实施方式中，l-异亮氨酸浓度达到15g/l左右时，调整溶氧。
10、在本专利技术的一个具体实施方式中，发酵过程还包括维持溶氧水平在25％-40％的过渡阶段。
11、优选地，通过自动调整转速维持过渡阶段的溶氧水平；优选地，溶氧降至25％-30％时进行转速自动调整。
12、优选地，达到转速设定上限后溶氧逐步下降为0；优选地，之后采取葡萄糖限制补料进行溶氧控制；进一步优选地，维持溶氧水平在5％-15％。
13、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述能转化为2-酮丁酸的原料包括苏氨酸、富马酸、天冬氨酸、高丝氨酸、丙酸、二氨基丁酸中的一种或几种。
14、优选地，其中能转化为2-酮丁酸的原料为苏氨酸；优选地，发酵体系中的苏氨酸浓度0.1-10g/l；进一步优选地，发酵体系中的苏氨酸浓度5-10g/l。
15、在本专利技术的一个具体实施方式中，在发酵体系中加入葡萄糖；优选地，使发酵体系中葡萄糖浓度为0-10g/l。
16、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述发酵在发酵罐中进行；优选地，所述发酵罐的体积大于或等于1l。
17、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述微生物为野生或基因工程改造过的大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌(bacillus)、酵母(yeast)、棒杆菌(corynebacterium)、短杆菌(brevibacterium)或链霉菌(streptom本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种微生物发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，包括采用微生物进行发酵的步骤，所述发酵包括微生物增殖/异亮氨酸生产阶段和氨基酸联产阶段，发酵结束后从培养物中分离出L-异亮氨酸和L-缬氨酸，其中培养物中L-缬氨酸和L-异亮氨酸的质量比大于或等于20％；其特征在于：
2.根据权利要求1所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，溶氧控制方式包括：调整转速、调整通风量或葡萄糖限制补料或上述方式的联合使用。
3.根据权利要求1或2所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，在微生物增殖/异亮氨酸生产阶段控制溶氧不低于30％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，菌体生物量OD600至20左右时，调整溶氧。
5.根据权利要求1-3任一项所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，L-异亮氨酸浓度达到15g/L左右时，调整溶氧。
6.根据权利要求1-3任一项所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，发酵过程还包括维持溶氧水平在25％-40％的过渡阶段。
7.根据权利要
8.根据权利要求7所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，达到转速设定上限后溶氧逐步下降为0；优选地，之后采取葡萄糖限制补料进行溶氧控制；进一步优选地，维持溶氧水平在5％-15％。
9.根据权利要求1-8任一项所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，所述能转化为2-酮丁酸的原料包括苏氨酸、富马酸、天冬氨酸、高丝氨酸、丙酸、二氨基丁酸中的一种或几种。
10.根据权利要求9所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，其中能转化为2-酮丁酸的原料为苏氨酸；优选地，发酵体系中的苏氨酸浓度0.1-10g/L；进一步优选地，发酵体系中的苏氨酸浓度5-10g/L。
11.根据权利要求1-10任一项所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，在发酵体系中加入葡萄糖；优选地，使发酵体系中葡萄糖浓度为0-10g/L。
12.根据权利要求1-10任一项所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，所述发酵在发酵罐中进行；优选地，所述发酵罐的体积大于或等于1L。
13.根据权利要求1-10任一项所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，所述微生物为野生或基因工程改造过的大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母(Yeast)、棒杆菌(Corynebacterium)、短杆菌(Brevibacterium)或链霉菌(Streptomyces)。
14.根据权利要求1-10任一项所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，所述微生物进一步包括苏氨酸脱氨酶的基因，优选地为实质上解除了L-异亮氨酸抑制的相应基因；进一步优选的，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因为解除型ilvA基因或者tdcB基因。
15.根据权利要求1-10任一项所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，所述的微生物进一步包括苏氨酸脱水酶基因、苏氨酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvC)、二羟酸脱水酶基因(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilvE)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种。
16.根据权利要求1-10任一项所述的发酵联产L-异亮氨酸和L-缬氨酸的方法，所述的微生物进一步将碳代谢流最大化集中到丙酮酸并导向目标氨基酸，所述微生物中乙醇、乙酸、乳酸为代表的杂酸杂醇代谢副产物的生成通路被减弱或阻断，例如下列基因ldhA、adhE、pta、poxB的活性分别或同时被减弱或消除。
...【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，包括采用微生物进行发酵的步骤，所述发酵包括微生物增殖/异亮氨酸生产阶段和氨基酸联产阶段，发酵结束后从培养物中分离出l-异亮氨酸和l-缬氨酸，其中培养物中l-缬氨酸和l-异亮氨酸的质量比大于或等于20％；其特征在于：
2.根据权利要求1所述的发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，溶氧控制方式包括：调整转速、调整通风量或葡萄糖限制补料或上述方式的联合使用。
3.根据权利要求1或2所述的发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，在微生物增殖/异亮氨酸生产阶段控制溶氧不低于30％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，菌体生物量od600至20左右时，调整溶氧。
5.根据权利要求1-3任一项所述的发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，l-异亮氨酸浓度达到15g/l左右时，调整溶氧。
6.根据权利要求1-3任一项所述的发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，发酵过程还包括维持溶氧水平在25％-40％的过渡阶段。
7.根据权利要求6所述的发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，通过自动调整转速维持过渡阶段的溶氧水平；优选地，溶氧降至25％-30％时进行转速自动调整。
8.根据权利要求7所述的发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，达到转速设定上限后溶氧逐步下降为0；优选地，之后采取葡萄糖限制补料进行溶氧控制；进一步优选地，维持溶氧水平在5％-15％。
9.根据权利要求1-8任一项所述的发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，所述能转化为2-酮丁酸的原料包括苏氨酸、富马酸、天冬氨酸、高丝氨酸、丙酸、二氨基丁酸中的一种或几种。
10.根据权利要求9所述的发酵联产l-异亮氨酸和l-缬氨酸的方法，其中能转化为2-酮丁酸的原料为苏...
【专利技术属性】
技术研发人员：张科春，刘光辉，欧明花，孙村民，王靖宇，朱湘成，
申请(专利权)人：元素驱动杭州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。