甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法技术

本发明专利技术为“甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法”，属植物基因工程技术领域，包括如下步骤：１）选取幼穗，旗叶期长约２－５ｃｍ幼穗，切成薄片，２）将其接种于诱导培养基中培养，形成愈伤组织，３）将愈伤幼穗组织块在继代培养基中继代培养，４）再将其接于分化培养基中培养至出苗，５）将苗移入生根培养基中培养出根，６）转移至小培养钵中炼苗培养，７）移栽至温室或大田。本发明专利技术利用甜高粱幼穗为外植体，采用特定的培养基成分，不同的培养条件对愈伤诱导，增殖，分化，直至得到再生植株，本发明专利技术方法能得到较高的愈伤组织诱导率，实验结果表明幼穗是建立甜高粱再生体系比较理想的一种外植体，可以用于进一步的转化研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程
，特别是涉及甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建 立的方法。
技术介绍
甜高粱是普通高粱的一个变种，生长耗水量仅为玉米的1/3，亩产可高达5 10 吨，其茎秆汁液是发酵制造酒精和培养酵母的理想生物质原料。用甜高粱取代玉米等粮食 作物作为原料生产酒精的新工艺，不仅能节约粮食、降低成本，有力地带动发酵产业、振兴 酒精生产行业、而且能推进可再生能源事业和畜牧业的发展。发展甜高粱产业关键在于甜 高粱新品种的选育与高效栽培。传统育种技术在甜高粱的产量、品质、抗病、抗虫等特性改 良方面已发挥了重要作用，但在生产上对品种、品质要求日益提高的情况下，因受现有资源 的限制，单靠传统的育种方法难以取得重大突破。利用转基因技术改良高粱品种已引起广 泛的关注。植物转基因技术通常依赖于植物快捷、高频率再生体系的建立。然而，甜高粱同 普通高粱一样，通过组织培养获得再生植株相对比较困难。目前针对甜高粱组织培养的研 究还很少。从甜高粱的成熟胚和未成熟胚诱导愈伤到获得整个再生植株以前虽已有过一些 艮道(MacKinnon et al.，1986，Plant Cell Rep. 5 :349_351 ；Ma et al.，1987，Theor App Genet. 73 389-394 ；Rao and Kavi Kishor，1989，Curr Sci. 58 :692_693)，但遗憾的是能 够从外植体诱导胚性愈伤到再生出植株的仅限于个别几个品种(Smith and Bhaskaran, 1986，Springer-Verlag, New York, pp. 220-223 ；Rao et al.，1995，Plant Cell Rep. 15 72-75)。近年来随着人们对甜高粱应用价值的重视，甜高粱组织培养方面的研究也取得了 快速的发展。通过对不同基因型品种及外植体、不同培养基成分(包括蔗糖浓度和激素配 比等)、不同培养条件对愈伤的诱导、增殖及分化再生能力的影响进行系统研究，为甜高粱 品种建立有效的组织培养再生体系提供了参考(Zhao et al. ,2008,Chinese Bull Bot. 25 465-468 ；Zhao et al. ,2010,African Journal of Biotechnology. 9(16) :2367_2374)。但 以上研究大多是以甜高粱的成熟胚和未成熟胚为外植体，目前为止以幼穗为外植体的研究 尚很少见有报道。近年来各国科学家正在致力于相关方面的研究，相比其它作物，甜高粱组织培养 植株再生困难，而且受基因型的限制，因此甜高粱遗传转化研究进展缓慢，目前尚很少见成 功报道。据报道，2009年美国昆士兰大学的研究人员培育出了世界上首例木质素含量降低 的转基因甜高粱植株，他们将编码咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)和咖啡酸-0-甲 基转移酶(COMT)的DNA片段导入甜高粱品种中，通过改变木质素的含量和组分获得了成 功，该项研究成果已申请了专利(Pub. No. US 2010/0058496A1)。其它研究尚未见相关报道。因此建立甜高粱的遗传转化体系，通过转基因技术培育甜高粱新品种，使其更好 地满足实际生产的需求。转化体系的研发将为绿色能源生物燃料和生物材料的开发利用开 辟新的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以甜高粱幼穗材料的组织培养形成再生体系，为以甜高 粱幼穗诱导的愈伤组织的组织培养再生体系及遗传转化方法提供基础研究。，包括如下步骤1)选取幼穗，旗叶期 长约2-5cm幼穗，切成薄片，2)将其接种于诱导培养基中培养，形成愈伤组织，所述诱导培 养基为MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT (玉米素)2. Omg/L+PVP (聚乙烯吡咯烷酮)IOmg/ L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7. 2g/L琼脂pH 5. 8，3)将愈伤幼 穗组织块在继代培养基中继代培养，所述继代培养基为诱导培养基+KT(激动素)0. 2mg/ L，4)再将其接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为MS基础培养基+ZT2.0mg/ L+KT 0. 2mg/L+PVP 8-lOmg/L+水解酪蛋白 500mg/L+30g/L 蔗糖+8. Og/L 琼脂，pH 5.8， 5)将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为1/2MS基础培养基+肌醇500mg/ L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8_10mg/L+30g/L 蔗糖+8. Og/L 琼脂，pH5. 8，6)转移至小培 养钵中炼苗培养，7)移栽至温室或大田。优选2_3cm幼穗，薄片约3mm长。所述诱导培养基中培养条件为于20 21°C暗培养3 4周。所述继代培养为每7-10天继代一次。所述分化培养基中的培养条件为于26_28°C光培养2 3周。所述培养出根的标准为苗高3 5cm，根长2 3cm。所述炼苗培养的时间约7-15天。所述甜高粱品种为“BABUSH”和“MN-3025”。本专利技术通过对植物激素配比、培养基成分、不同基因型等因素对甜高粱组织培养 的影响比较发现，培养基中添加玉米素2. Omg/L对于幼穗愈伤组织的诱导具有重要的作 用，可以大幅度提高诱愈率；同时在培养基中适量添加8-10mg/L PVP和10mg/L抗坏血酸， 可以有效地减轻褐化现象，促进诱愈率的提高。本专利技术建立了甜高粱幼穗愈伤组织培养再 生体系其中愈伤组织诱导培养基为MS基础培养基+2，4-D 2mg/L+ZT 2. 0mg/L+水解酪蛋 白 500mg/L+PVPl0mg/L+ 抗坏血酸 10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 7. 2g/L，pH 5. 8 ；继代培养基 为诱导培养基+KT 0. 2mg/L ；分化培养基为MS+ZT 2. 0mg/L+KT 0. 2mg/L+PVP 8-10mg/L+ 水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8. 0g/L琼脂，pH 5. 8 ；生根培养基为1/2MS+肌醇500mg/ L+NAA 400mg/L+IBA 2mg/L+PVP 8-10mg/L+ 蔗糖 30g/L+8. Og/L 琼脂，pH 5. 8。本专利技术利用甜高粱幼穗为外植体，采用特定的培养基成分，不同的培养条件对愈 伤诱导，增殖，分化，直至得到再生植株，本专利技术方法能得到较高的愈伤组织诱导率，但是， 不同基因型来源的愈伤组织的胚性状况及再生能力差别较大。实现结果表明幼穗是建立甜 高粱再生体系比较理想的一种外植体，可以用于进一步的转化研究。附图说明图1 甜高粱幼穗组织培养再生体系示意图。a 幼穗切片接种于诱导培养基；b 诱导产生愈伤；c 愈伤继代培养；d 愈伤分化 出苗；e 幼苗移入生根培养基；f 幼苗生根；g 移栽温室；h 植株结实。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。下面所用的材料均有来源，公众还可以免费从申请人的实验室中得到。1.用于甜高粱组织培养的幼穗材料选择与准备本专利技术取旗叶期长约2 5cm的幼穗，用70%酒精进行表面消毒3min，无菌水冲 洗多次；在超净台中用刀切成大小均一的薄片接种于诱导培养基[MS基础培养基+2，4-本文档来自技高网...

【技术保护点】
甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法，包括如下步骤：１）选取幼穗，旗叶期长约２－５ｃｍ幼穗，切成薄片，２）将其接种于诱导培养基中培养，形成愈伤组织，所述诱导培养基为：ＭＳ基础培养基＋２，４－Ｄ　２ｍｇ／Ｌ＋ＺＴ　２．０ｍｇ／Ｌ＋ＰＶＰ　１０ｍｇ／Ｌ＋抗坏血酸１０ｍｇ／Ｌ＋水解酪蛋白５００ｍｇ／Ｌ＋３０ｇ／Ｌ蔗糖＋７．２ｇ／Ｌ琼脂ｐＨ　５．８，３）将愈伤幼穗组织块在继代培养基中继代培养，所述继代培养基为：诱导培养基＋ＫＴ　０．２ｍｇ／Ｌ，４）再将其接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为：ＭＳ基础培养基＋ＺＴ　２．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ　０．２ｍｇ／Ｌ＋ＰＶＰ　８－１０ｍｇ／Ｌ＋水解酪蛋白５００ｍｇ／Ｌ＋３０ｇ／Ｌ蔗糖＋８．０ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ　５．８，５）将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为：１／２ＭＳ基础培养基＋肌醇５００ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　４００ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ　２ｍｇ／Ｌ＋ＰＶＰ８－１０ｍｇ／Ｌ＋３０ｇ／Ｌ蔗糖＋８．０ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ　５．８，６）转移至小培养钵中炼苗培养，７）移栽至温室或大田。

【技术特征摘要】
甜高粱幼穗愈伤组织再生体系建立的方法，包括如下步骤1)选取幼穗，旗叶期长约2 5cm幼穗，切成薄片，2)将其接种于诱导培养基中培养，形成愈伤组织，所述诱导培养基为MS基础培养基+2，4 D 2mg/L+ZT 2.0mg/L+PVP 10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L琼脂pH 5.8，3)将愈伤幼穗组织块在继代培养基中继代培养，所述继代培养基为诱导培养基+KT 0.2mg/L，4)再将其接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为MS基础培养基+ZT 2.0mg/L+KT 0.2mg/L+PVP 8 10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂，pH 5.8，5)将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为1/2MS基础培养基+肌醇50...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄大昉，朱莉，郎志宏，李桂英，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]