【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测，特别涉及一种不确定潜能的克隆性造血相关基因突变的检测方法及试剂盒。
技术介绍
1、衰老和体细胞突变导致了人类疾病的产生。随着年龄的增长，体细胞突变在造血干细胞(hemopoietic stem cells，hscs)中逐渐积累，导致克隆性造血(clonalhematopoiesis，ch)现象的发生。当克隆性造血发生在没有血液系统肿瘤等异常的个体中时被定义为意义不明的克隆性造血(clonal hematopoiesis of indeterminatepotential，chip)。其正式定义于2015年提出：在没有血液系统恶性肿瘤或不明原因的血细胞减少的情况下，在外周血中检测到癌症相关体细胞突变的ch，并满足变异等位基因频率(variant allele fraction,vaf)≥2％(意味着2％的测序等位基因包含突变，或大约4％的细胞，假设突变是杂合的)。克隆性造血与特定血细胞谱系扩展相关，同时也与衰老以及健康情况相关，比如与血液系统肿瘤、心血管疾病等风险增加有关。
2、衰老与几乎所有组织中体细胞突变数量的稳定增加有关。这些与年龄相关的突变分为四类。最常见的一类来自5-甲基胞嘧啶自发脱氨为胸腺嘧啶；第二类突变是小插入和缺失(插入缺失)，通常由dna双链断裂的非同源末端连接过程中引入的错误引起；突变的第三种机制是dna聚合酶的复制错误，这通常也会导致碱基替换或小插入缺失；第四种类型的年龄相关突变是较大的结构变异，例如插入，缺失，杂合性丧失或跨越几千碱基或更多的重排。这些突变过程相结合，创造
3、参与表观遗传调控的基因突变(dnmt3a，tet2，asxl1)占人类突变驱动的克隆造血的大部分，其中dnmt3a在多个研究中都显示为突变频率最高的基因。这些突变在年轻人中很少见，但在老年人中非常普遍，10岁以上的人中有20％至70％携带可观大小的克隆。哈佛大学医学院血液科的siddhartha jaiswal等进行了一项研究，其结果显示在年龄低于40岁的人中罕见可检测到体细胞突变，但其频率随年龄增长显著增加；在年龄70-79岁、80-89岁和90-108岁的人中，分别有9.5％(219/2300例)、11.7％(37/317例)和18.4％(19/103例)观察到克隆的突变。大多数突变发生在dnmt3a、tet2和asxl1这三个基因。同时研究发现年龄相关的克隆造血与血液肿瘤风险和全因死亡率的增加有关。
4、虽然chip与血液恶性肿瘤之间存在联系是预期的，但几项大型研究结果发现，chip与心血管疾病(cvd)死亡率增加有关。进一步的分析表明，chip携带者未来缺血性中风和冠心病的风险增加了一倍以上。与没有chip的个体相比，携带dnmt3a，tet2或asxl1突变的个体患冠心病的相对风险大约翻了一番；在携带jak2突变的个体中，与没有chip的个体相比，相对风险高约12倍。此外，具有较大突变克隆的个体患心血管疾病的风险最大，反映了恶性肿瘤风险的情况。chip与心血管结局之间的联系不仅限于动脉粥样硬化性疾病。最近的证据表明，携带chip相关dnmt3a或tet2突变的心肌梗死后充血性心力衰竭患者的生存结果比没有chip的个体更差。在另一项研究中，据报道，具有chip相关jak2突变的个体发生静脉血栓形成的风险比没有chip的个体高12倍，而具有其他chip相关基因突变的个体的风险增加了一倍。因此，chip可作为几种不同心血管疾病预后不良的指标。
5、由于许多与chip相关的基因都参与转录调控，最近的研究发现，tet2或dnmt3a的缺失增加了巨噬细胞和肥大细胞的炎症反应。新兴的工作还表明这些突变对t细胞功能的影响，这可能影响对肿瘤的免疫反应。迄今为止，越来越多的证据支持通常突变的chip基因在免疫功能中的作用，chip可能是称为“炎症”现象的某些部分的基础，即与年龄相关的全身炎症增加。而炎症反应也是cvd的主要发病机制之一。它主要的发病机理可以概括为，chip相关基因的突变放大了炎症反应，同时chip患者炎症标志物水平升高，增加了cvd风险。因此，chip相关的突变基因可用来作为预防或改善ch和ch相关疾病诊断的标志物以及潜在的治疗靶点。
6、杂交捕获法是目前常用的序列捕获方法之一。通过目标dna片段和已带有生物素标记探针特异性杂交方式将目标序列捕获和分离出来。这一技术在二代测序平台中应用较为广泛，尤其是液相杂交捕获方法在目标区域捕获
有着独有的优势。液相杂交捕获技术可以克服上述pcr法和分子倒置探针法的问题，具有更好的捕获效率，更少的偏好性，更高的检测灵敏度，更简便的操作和适合的成本等优点。
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术的目的在于提供了一种高效而低成本的chip相关基因突变的检测方法及试剂盒，本专利技术提供的chip相关基因突变的检测试剂盒可应用于衰老评估、心血管疾病、肿瘤风险评估、免疫功能评价中。
2、本专利技术的目的通过如下技术方案实现的：
3、本专利技术提供一种chip相关基因突变的检测方法，包括以下步骤：
4、(1)提取样本基因组dna，经过dna片段化、末端修复、末端加“a”、连接illumina测序平台专用index测序接头，纯化产物；
5、(2)将步骤(1)纯化产物进行pcr扩增，通过ampure xp磁珠纯化；
6、(3)将步骤(2)纯化的产物与捕获探针进行探针液相杂交捕获，捕获chip相关基因突变片段，然后纯化得到捕获后产物片段；
7、(4)对步骤(3)所得的产物片段进行pcr扩增富集，然后利用ampure xp磁珠对扩增产物进行纯化回收，质检合格后得到上机文库；
8、(5)使用illumina高通量测序平台进行测序，通过生物信息学对得到实验数据进行分析，获得chip相关基因的突变情况。
9、进一步地，步骤(1)中所述的样本基因组dna通过qiaamp dna blood mini kit试剂盒提取获得，使用qubit 3.0进行dna浓度检测，使用nanodrop检测其纯度。
10、进一步地，步骤(1)中所述的dna片段化、末端修复、末端加“a”通过fragment&eraenzyme mix反应体系完成。
11、进一步地，步骤(1)中所述的纯化通过ampure xp磁珠进行。
12、进一步地，步骤(2)中pcr扩增的参数：热盖温度105℃，98℃1min；98℃20s，60℃30s，72℃30s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CHIP相关基因突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的样本基因组DNA通过QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取获得，使用Qubit 3.0进行DNA浓度检测，使用Nanodrop检测其纯度；所述的DNA片段化、末端修复、末端加“A”通过Fragment&ERA EnzymeMix反应体系完成。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增的参数：热盖温度105℃，98℃1min；98℃20s，60℃30s，72℃30s，共10个循环；72℃2min，4℃ever。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的探针液相杂交捕获是通过探针液相杂交捕获试剂盒完成；所述的探针液相杂交捕获目标区域为CHIP相关的15个突变基因的不同突变区域。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中PCR扩增的参数：95℃1min；98℃20s，60℃30s，72℃30s，共16个循环；7
6.一种用于权利要求1-5任一项所述的检测方法的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括以下成分：基因组DNA文库构建的试剂、PCR扩增及纯化的试剂、探针液相杂交的试剂以及文库扩增富集的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述基因组DNA文库构建的试剂主要包括基因组DNA提取试剂、文库构建中DNA片段化、末端修复、加“A”及连接接头所需要的酶、缓冲液及illumina测序平台专用index测序接头。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增及纯化回收试剂主要包括PCR扩增反应体系、磁珠以及纯化所用的洗脱缓冲液。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述探针液相杂交的试剂主要包括捕获探针、捕获磁珠和洗脱缓冲液。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的文库扩增富集试剂主要包括文库扩增所需要的酶及缓冲液以及产物回收纯化所需要的链霉亲合素磁珠。
...【技术特征摘要】
1.一种chip相关基因突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的样本基因组dna通过qiaamp dna blood mini kit试剂盒提取获得，使用qubit 3.0进行dna浓度检测，使用nanodrop检测其纯度；所述的dna片段化、末端修复、末端加“a”通过fragment&era enzymemix反应体系完成。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中pcr扩增的参数：热盖温度105℃，98℃1min；98℃20s，60℃30s，72℃30s，共10个循环；72℃2min，4℃ever。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的探针液相杂交捕获是通过探针液相杂交捕获试剂盒完成；所述的探针液相杂交捕获目标区域为chip相关的15个突变基因的不同突变区域。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中pcr扩增的参数：95℃1min；98℃20s，60℃30s，72℃30s，共16个循环；72℃5min，4℃ever；步骤(5)中所述的illumina...
【专利技术属性】
技术研发人员：李宏志，宋吉雪，许立志，明鸿博，李丽珍，李杰，
申请(专利权)人：大连晶泰医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。