【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体为封闭taq dna聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体及应用。
技术介绍
1、taq dna聚合酶来源于水生栖热菌(thermus aquaticus)，同时具有dna聚合酶和5’→3’外切酶活性。taq dna聚合酶热稳定性极好，最适反应温度在74℃左右，在95℃的高温下还可以保持稳定，被广泛用于聚合酶链式反应(pcr)和实时荧光定量pcr(quantitative real-time pcr，qpcr)。
2、在对特异性和灵敏度要求较高的qpcr应用(如传染病检测、基因突变分析等)中，一般使用探针法。探针法是在qpcr扩增中加入一条与目标dna特异性互补配对的单链寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团。当探针保持完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号。qpcr反应时，如果有目标dna被扩增出来，探针就能与目标dna结合。而taq dna聚合酶沿目标dna模板行进到探针5’端时，其5’→3’外切酶活性就能将探针水解，使得报告基团和淬灭基团分离，从而发出荧光。理论上，切割释放的荧光分子数与pcr产物的数量成正比。因此，通过检测pcr反应体系中的荧光强度，就可以达到实时监测pcr产物扩增量的目的。
3、一般pcr(含qpcr)的反应程序包含预变性-变性-退火-延伸等步骤(有时可以将退火和延伸合并进行)，反应温度都在55℃以上。但是taq dna聚合酶在较低温度下也具有一定活性，这就会带来两个问题：(1)非特异性扩增，pcr反应体系配制过程和反
4、解决上述假阳性问题的主要策略是热启动，即在低温下封闭taq dna聚合酶的活性，然后在高温时将活性释放。最常用的技术手段是采用taq dna聚合酶的单克隆抗体。在低温下(一般低于55℃)，抗体与taq dna聚合酶特异性结合，封闭其活性；在高温下抗体与酶发生不可逆解离，将活性释放出来。
5、由于抗体与抗原结合的表位往往仅有几个氨基酸，因此对于taq dna聚合酶的不同突变体，同一个单克隆抗体的封闭效率会有很大差异。有文献报道，在野生型taq dna聚合酶基础引入e626k、i707l和e708q等三个氨基酸替换的突变体taq 22，其全血抑制抗性、土壤抑制抗性、荧光染料抑制抗性比野生型都有提高(kermekchiev et al,nucleic acidsresearch,2009,37:e40)，在分子诊断领域具有良好的应用价值；但现有taq dna聚合酶抗体大多针对野生型开发，对taq 22突变体的5’→3’外切酶活性封闭效果较差，为此提供了封闭taq dna聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体及应用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供封闭taq dna聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体及应用，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：封闭taq dna聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体，单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含三个决定簇互补区，分别为：hcdr1、hcdr2和hcdr3，其中hcdr1的氨基酸序列如seq id no：4所示，hcdr2的氨基酸序列如seq id no：5所示，hcdr3的氨基酸序列如seq id no：6所示；所述轻链可变区包含三个决定簇互补区，分别为lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述lcdr1的氨基酸序列如seq id no：7所示；所述lcdr2的氨基酸序列如seq id no：8所示；所述lcdr3的氨基酸序列如seq id no：9所示，taq dna聚合酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述重链可变区的氨基酸序列如seq idno.2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.3。
4、一种封闭taq dna聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：
5、s1：使用taq 22突变体蛋白免疫小鼠，利用杂交瘤技术制备具有分泌抗体的杂交瘤细胞，使用酶联免疫吸附法(elisa)筛选出含有特异性抗体的阳性细胞后进行单克隆；
6、s2：使用稀释后的阳性杂交瘤细胞接种小鼠，制备并采集腹水，使用elisa法测定腹水中的抗体效价；
7、s3：从高效价的腹水中提取抗体并进行亲和层析纯化；
8、s4：然后使用发夹底物和荧光探针，测试所获得的抗体对taq 22突变体5’→3’外切酶活性封闭效果，筛选出可以高效封闭taq 22突变体外切酶活性的抗体，封闭率最高可达99％以上。
9、一种封闭taq dna聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体在制备热启动taq dna聚合酶中的应用，在反应体系中抗体和taq dna聚合酶的摩尔比为3～5:1。
10、一种使用封闭taq dna聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体制备的热启动taqdna聚合酶突变体在qpcr中的应用，反应体系如下：热启动taq 22聚合酶(0.5u/μl)的用量为1.5μl；模板dna的用量为0.1-200ng；dntp(10mm each)的用量为0.4μl；正向引物(10μm)的用量为0.4μl；反向引物(10μm)的用量为0.4μl；荧光探针(10μm)的用量为0.5μl；10×taq反应缓冲液的用量为2μl；无核酸酶水的用量为to 20μl；
11、qpcr反应程序为：预变性95℃2min；以下40个循环：变性95℃10s，退火/延伸60℃30s。
12、本专利技术的有益效果是：本专利技术提供一种高效封闭taq 22突变体5’→3’外切酶活性的单克隆抗体，在低温下(<55℃)可以有效封闭99％以上的外切酶活性，在高温下即可释放活性；而且单克隆抗体还能在荧光定量pcr中的应用；本专利技术针对现有抗体封闭taq 22突变体外切酶效果不佳的问题，提供了能够高效封闭taq 22突变体的单克隆抗体。
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1.封闭Taq DNA聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体，其特征在于：单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含三个决定簇互补区，分别为：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No：6所示；所述轻链可变区包含三个决定簇互补区，分别为LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No：9所示，Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的封闭Taq DNA聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3。
3.一种如权利要求1所述的封闭Taq DNA聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体
4.一种如权利要求1所述的封闭Taq DNA聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体在制备热启动Taq DNA聚合酶中的应用，其特征在于：在反应体系中抗体和Taq DNA聚合酶的摩尔比为3～5:1。
5.一种使用权利要求1所述的封闭Taq DNA聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体制备的热启动Taq DNA聚合酶突变体在qPCR中的应用，其特征在于：反应体系如下：热启动Taq22聚合酶(0.5U/μL)的用量为1.5μL；模板DNA的用量为0.1-200ng；dNTP(10mM each)的用量为0.4μL；正向引物(10μM)的用量为0.4μL；反向引物(10μM)的用量为0.4μL；荧光探针(10μM)的用量为0.5μL；10×Taq反应缓冲液的用量为2μL；无核酸酶水的用量为To 20μL；
...【技术特征摘要】
1.封闭taq dna聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体，其特征在于：单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含三个决定簇互补区，分别为：hcdr1、hcdr2和hcdr3，其中hcdr1的氨基酸序列如seq id no：4所示，hcdr2的氨基酸序列如seq id no：5所示，hcdr3的氨基酸序列如seq id no：6所示；所述轻链可变区包含三个决定簇互补区，分别为lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述lcdr1的氨基酸序列如seq id no：7所示；所述lcdr2的氨基酸序列如seq id no：8所示；所述lcdr3的氨基酸序列如seq id no：9所示，taq dna聚合酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的封闭taq dna聚合酶突变体外切酶活性的单克隆抗体，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id ...
【专利技术属性】
技术研发人员：任宏杰，李锦辉，高尊防，张旭宁，邓锐，唐雨婷，
申请(专利权)人：江苏百时美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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