【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于珍稀植物组培快繁，具体涉及一种黑峰秋海棠的组培快繁方法。
技术介绍
1、黑峰秋海棠( begoniaferox) 是秋海棠科（ begoniaceae）秋海棠属（ begonia）的一种地生小型草本，仅分布于中国弄岗国家级自然保护区石灰岩壁上，叶面具有显着黑色突起。因叶片独特形状被商业开采严重，导致现存个体数量少，已被世界自然保护联盟（iucn）评为极危等级（cr），国家重点保护野生植物名录（2021版）收录为国家二级重点保护野生植物。黑峰秋海棠花叶兼赏、极具开发价值。
2、近年来，关于黑峰秋海棠的研究相对较少，仅集中在野外资源调查方面。2019年，以中国野生植物保护协会秋海棠专业委员会为首的团队完成了包括黑峰秋海棠等的秋海棠属植物资源野外调查，初步明确了黑峰秋海棠野外资源分布本底。目前有关黑峰秋海棠繁育的研究基本处于空白地带，其活体植物的可持续保存仍然是个巨大的挑战，这些都严重制约了黑峰秋海棠资源的保存保护。组织培养作为一种生物技术，相比于扦插、嫁接的繁殖速度快，在植物的繁育领域中得到了广泛的应用。
3、cn116849126a公开了一种黑峰秋海棠种质资源离体保存的方法，以黑峰秋海棠新长出未完全展开的叶片为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织的诱导、愈伤组织脱分化诱导不定芽、不定芽继代增殖培养、生根壮苗培养、试管苗移栽环节成功进行了其种苗的规模化繁殖。但是其在每一个阶段都需要单独配制特定的
4、此外黑峰秋海棠由于植株表面覆盖一层绒毛，导致组织培养时极难消毒彻底，带来污染率较高的问题，且移栽成活率仍处于较低水平。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术提供一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，繁殖系数高、生根数量多、移栽成活率高，提高了黑峰秋海棠的繁育效率，保护了黑峰秋海棠种质资源。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，包括以下步骤：
3、（1）外植体获取与消毒：以长势良好、饱满无病虫害的一年生叶片为外植体，刷洗去除绒毛，经冲洗消毒后得到外植体；
4、（2）不定芽的诱导：将外植体切割、划伤后接种至诱导培养基中，诱导培养出不定芽；
5、（3）壮苗培养：将不定芽分割成2-4个不定芽后接种至壮苗培养基，培养壮苗；
6、（4）生根培养：将步骤（3）中壮苗后的不定芽分成单株，接种至生根培养基中，培养得到生根苗；
7、（5）炼苗移栽：将步骤（4）中得到的生根苗经炼苗后冲洗，并置于保根缓苗液中浸泡，然后移栽至移栽基质中。
8、优选的，步骤（1）所述的冲洗为用质量浓度为0.3%的洗洁精浸泡15-30min后流水冲洗30-60min；所述消毒方式为先用75%的酒精溶液消毒15-20s，无菌水冲洗2-5次，然后用0.1%hgcl2振摇灭菌1.5-3min，无菌水冲洗3-5次。
9、优选的，步骤（2）所述的外植体切割方式为切除边缘部分，然后将剩余外植体分割成面积为2-4cm2。
10、优选的，步骤（2）所述的诱导培养基配方为1/2ms+6-ba 0.8-1.0 mg/l+naa 1.0mg/l+2，4-d 0.1-0.2 mg/l。
11、优选的，步骤（2）所述的诱导培养的条件为25℃下暗培养20-25d得到愈伤组织，再在光照强度为1000-1200lx交替培养15-20d产生不定芽，最后在光照强度为1400-1500lx、27℃下交替培养8-10d促进不定芽生长；其中产生不定芽时的光照12h，黑暗12h；促进不定芽生长时的光照14h，黑暗10h。
12、优选的，步骤（3）所述的壮苗培养基为1/2ms+naa 0.2 mg/l+iba 0.1 -0.2mg/l；培养条件为25℃、光照强度1800 lx条件下交替培养18-23d，其中光照14h，黑暗10h。
13、优选的，步骤（4）所述的1/2ms+naa 0.2 mg/l；培养条件为21℃暗培养4-8d，再在25℃、光照强度3000 lx条件下交替培养15-20d，其中光照16h，黑暗8h。
14、优选的，步骤（5）所述的保根缓苗液配方为芒萁叶片提取液1-5份、维生素b12 1-3份米醋3-8份；。
15、优选的，所述的的芒萁叶片提取液的制备方法取新鲜芒萁叶片，粉碎后溶解于水中，静置过滤得到，其中芒萁叶片的质量分数为0.8-1.5%。
16、优选的，步骤（5）所述的炼苗条件为温度为22-26℃、湿度为50-60%、光照强度为2300-2600lx炼苗5-10d；所述移栽基质由石灰岩碎渣：泥炭土：蛭石：黄壤按照体积比为3：1：1：2组成。
17、本专利技术的有益效果在于：
18、1、对黑峰秋海棠叶片表面的绒毛和污渍进行刷洗去除，解决了黑峰秋海棠外植体消毒不彻底的问题，降低了后续培养过程中污染率；其中叶片选用的是一年生叶片，降低了外植体选择的门槛，具有量多、不受季节限制、便于规模化培育等优点。
19、2、根据野外调查发现黑峰秋海棠存在伴生物种——芒萁，在有芒萁生长的地方，黑峰秋海棠能生长的更好，因此制备芒萁叶片提取液，并与维生素b12和米醋制备得到保根缓苗液，利用芒萁中含有某些天然成分来促进黑峰秋海棠的生长，提高移栽成活率。
20、3、将石灰岩碎渣与泥炭土、蛭石和黄壤配制移栽基质，为黑峰秋海棠营造一种类似原生境的移栽环境，进一步提高黑峰秋海棠的移栽成活率。
21、4、简化了组培流程，将愈伤组织的诱导、愈伤组织脱分化诱导不定芽、不定芽继代增殖培养三个阶段简化为一个阶段，仅采用同一种培养基，通过调整光照强度和光照周期来调控切换两个阶段，缩短了育苗周期，100d成苗，达到移栽要求。
22、5、本专利技术不受季节限制，能够有效的保持植株的优良品质，批量繁殖，短时间内可繁育大量苗木。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（1）所述的冲洗为用质量浓度为0.3%的洗洁精浸泡15-30min后流水冲洗30-60min；所述消毒方式为先用75%的酒精溶液消毒15-20s，无菌水冲洗2-5次，然后用0.1%HgCl2振摇灭菌1.5-3min，无菌水冲洗3-5次。
3.根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（2）所述的外植体切割方式为切除边缘部分，然后将剩余外植体分割成面积为2-4cm2。
4. 根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（2）所述的诱导培养基配方为1/2MS+6-BA 0.8-1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2，4-D 0.1-0.2 mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（2）所述的诱导培养的条件为25℃下暗培养20-25d得到愈伤组织，再在光照强度为1000-1200lx交替培养15-20d产生不定芽，
6. 根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（3）所述的壮苗培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.1 -0.2mg/L；培养条件为25℃、光照强度1800lx条件下交替培养18-23d，其中光照14h，黑暗10h。
7. 根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（4）所述的1/2MS+NAA 0.2 mg/L；培养条件为21℃暗培养4-8d，再在25℃、光照强度3000 lx条件下交替培养15-20d，其中光照16h，黑暗8h。
8. 根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（5）所述的保根缓苗液配方为芒萁叶片提取液1-5份、维生素B12 1-3份，米醋3-8份。
9.根据权利要求8所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：所述的的芒萁叶片提取液的制备方法取新鲜芒萁叶片，粉碎后溶解于水中，静置过滤得到，其中芒萁叶片的质量分数为0.8-1.5%。
10.根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（5）所述的炼苗条件为温度为22-26℃、湿度为50-60%、光照强度为2300-2600lx炼苗5-10d；所述移栽基质由石灰岩碎渣：泥炭土：蛭石：黄壤按照体积比为3：1：1：2组成。
...【技术特征摘要】
1.一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（1）所述的冲洗为用质量浓度为0.3%的洗洁精浸泡15-30min后流水冲洗30-60min；所述消毒方式为先用75%的酒精溶液消毒15-20s，无菌水冲洗2-5次，然后用0.1%hgcl2振摇灭菌1.5-3min，无菌水冲洗3-5次。
3.根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（2）所述的外植体切割方式为切除边缘部分，然后将剩余外植体分割成面积为2-4cm2。
4. 根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（2）所述的诱导培养基配方为1/2ms+6-ba 0.8-1.0 mg/l+naa 1.0 mg/l+2，4-d 0.1-0.2 mg/l。
5.根据权利要求1所述的一种黑峰秋海棠的组培快繁方法，其特征在于：步骤（2）所述的诱导培养的条件为25℃下暗培养20-25d得到愈伤组织，再在光照强度为1000-1200lx交替培养15-20d产生不定芽，最后在光照强度为1400-1500lx、27℃下交替培养8-10d促进不定芽生长；其中产生不定芽时的光照12h，黑暗12h；促进不定芽生长时的光照14h，黑暗10h。
【专利技术属性】
技术研发人员：张广欣，黄桂云，吴锦华，吴笛，杨兰芳，禹云超，肖之强，詹鹏，马晓波，李重新，
申请(专利权)人：中国长江三峡集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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