【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程的，具体涉及一种烯醛还原酶突变体、鼠李糖苷酶突变体、三酶表达菌株及其应用。
技术介绍
1、新橙皮苷二氢查耳酮（nhdc）的甜度虽然为蔗糖的 1800倍，但其有类似甘草的不良后苦味，加上在水中的溶解度仅仅为 0.5 g/l，这在一定程度上限制了它的应用。这就导致了现阶段新橙皮昔二氢查耳酮在食品、医药日化、饲料等行业的使用需要复配其他甜味剂或者口味矫正剂。而橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷（hcg）是一种低热量的非营养性的甜味剂，虽其甜度约为蔗糖的300-500倍，但甜味纯正，无苦味和后味，并具有果实风味。
2、目前二氢查耳酮的制备方法主要以化学法为主，以二氢黄酮为底物，在碱性条件以及铂、钯等金属催化剂作用下加氢，最后生成二氢查耳酮。化学法容易污染环境，且含副产物，用于食品添加物的制备存在一点安全隐患，而生物合成法的反应条件温和，环保安全，具有极高的专一性，是理想的制备途径，但是目前未见有以橙皮苷为原料，一步法生物合成橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷、橙皮素二氢查耳酮等二氢查耳酮系列产物的相关报道。
3、α-l-鼠李糖苷酶（α-l-rhamnosidase，ec 3.2.1.40）是一类具有广阔应用前景的糖苷水解酶，在植物、动物和微生物中广泛存在，能够将以醇羟基和半缩醛反应形成的糖苷键以外切或内切的方式断裂，在生物体中糖缀合物以及糖的合成和水解的过程中起到很重要的作用。烯醛还原酶（2-alkenal reductase）可以催化烯醛基中不饱和双键的加氢还原，生成饱和的醛，然后再由其它的醛还原酶作用生成二氧
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种烯醛还原酶突变体，其能解决目前烯醛还原酶催化转化效果不佳的问题。
2、本专利技术的目的之二在于提供一种烯醛还原酶的应用，其与查耳酮异构酶突变体联用，以橙皮苷为原料用于制备橙皮苷二氢查耳酮组合物，转化率高。
3、本专利技术的目的之三在于提供一种三酶表达菌株，能同时表达查耳酮异构酶、烯醛还原酶和鼠李糖苷酶。
4、本专利技术的目的之四在于提供一种三酶表达菌株的应用，能用于生产橙皮苷单葡萄糖苷二氢查耳酮组合物。
5、本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
6、一种烯醛还原酶or突变体，所述烯醛还原酶突变体为氨基酸序列如seq id no：1所示的第662位的谷氨酰胺突变为半胱氨酸以及第462位的天冬氨酸突变为谷氨酸。所以该突变体记为or-q662a-d462e。
7、本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：
8、烯醛还原酶突变体用于还原橙皮苷制备橙皮苷二氢查耳酮。
9、优选地，所述烯醛还原酶突变体联合查耳酮异构酶突变体催化转化橙皮苷制备橙皮苷二氢查耳酮组合物。
10、本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：
11、一种三酶表达菌株，所述菌株是烯醛还原酶or突变体、鼠李糖苷酶rhab2突变体、查耳酮异构酶cmchim突变体的质粒表达菌株；其中，所述查耳酮异构酶cmchim突变体的氨基酸序列为如seq id no：9所示的查耳酮异构酶的第120位的色氨酸突变为组氨酸，第183位的亮氨酸突变为酪氨酸，其核苷酸序列如seq id no：10所示；所述鼠李糖苷酶突变体的氨基酸序列为如seq id no：5所示的鼠李糖苷酶的第227位的色氨酸突变为异亮氨酸。所以该突变体即为突变体rhab2-w227i。该鼠李糖苷酶突变体用于制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷。
12、即该三酶表达菌株能同时表达查耳酮异构酶突变体cmchim、烯醛还原酶or和鼠李糖苷酶rhab2，所述or为or野生型或其突变体，所述rhab2为rhab2野生型或其突变体。
13、本专利技术的目的之四用如下技术方案实现：
14、三酶表达菌株在制备橙皮苷二氢查耳酮组合物中的应用。
15、优选地，所述橙皮苷二氢查耳酮组合物为橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷，其制备方法，包括以下步骤：将所述三酶表达菌株制成全细胞酶液，然后加入葡萄糖苷酶、橙皮苷和缓冲液，在25~35℃下反应，得到所述橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷。采用三酶表达菌株能在温和条件下制备橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷，解决了天然酶反应环境难以满足的技术问题。
16、本专利技术实际上是利用该菌株能同时查耳酮异构酶cmchim、烯醛还原酶or、鼠李糖苷酶rhab2的能力，通过同时表达上述三种酶，能直接将橙皮苷转化为橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷组合物。具体地，是其中的烯醛还原酶和查耳酮异构酶将橙皮苷转化为橙皮苷二氢查耳酮组合物，然后鼠李糖苷酶将橙皮苷二氢查耳酮转化为橙皮素二氢查耳酮葡萄糖苷组合物。
17、具体地，上述三酶表达菌株的构建方法，包括以下步骤：
18、（1）构建查耳酮异构酶cmchim和烯醛还原酶or与载体的重组质粒，得到查耳酮异构酶-烯醛还原酶重组质粒；其中，载体为大肠杆菌，即为pet28a-cmchim-or质粒；
19、（2）构建鼠李糖苷酶质粒；其中，载体为大肠杆菌，记为pet32a-rhab2质粒；
20、（3）在步骤（1）所得的pet28a-cmchim-or质粒中构建并筛选查耳酮异构酶突变体cmchim与烯醛还原酶突变体or-q662a-d462e的组合物；记为cmchim-or-q662a-d462e；
21、（4）在步骤（2）所得的鼠李糖苷酶质粒中构建并筛选鼠李糖苷酶突变体rhab2-w227i；
22、（5）将所述查耳酮异构酶突变体与烯醛还原酶突变体的组合物和鼠李糖苷酶突变体共转化至载体中，在培养基中筛选出阳性转化子，得到所述三酶表达菌株。
23、需要注意的是，查耳酮异构酶cmchim、烯醛还原酶or、鼠李糖苷酶rhab2的载体组合形式包括但不限于上述方法，也可以是三种酶采用不同载体进行组合，也可以是先两个组合后再与最后一个组合。三种酶的组合方式不影响三酶的表述效果。
24、优选地，所述步骤（1）中，所述查耳酮异构酶-烯醛还原酶重组质粒的构建方法，包括以下步骤：以氨基酸序列如seq id no .1所示，核苷酸序列如seq id no .2所示的合成查耳酮异构酶基因为模板，合成如序列表中seq id no: 3和seq id no: 4的两条引物，在合成的引物，两端分别加nde i和ecor i两个酶切位点，进行pcr，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的pcr产物连入查耳酮异构酶与载体的质粒中，筛选出阳性转化子，得到查耳酮异构酶-烯醛还原酶重组质粒。
25、优选地，所述步骤（2）中，所述鼠李糖苷酶质粒的构建方法，包括以下步骤：以氨基酸序列如seq id no .5所示，核苷酸序列如seq id no .6所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种烯醛还原酶突变体，其特征在于，所述烯醛还原酶突变体为氨基酸序列如SEQID NO：1所示的第662位的谷氨酰胺突变为半胱氨酸以及第462位的天冬氨酸突变为谷氨酸。
2.权利要求1所述的烯醛还原酶突变体在还原橙皮苷制备橙皮苷二氢查耳酮中的应用。
3.如权利要求2所述的烯醛还原酶突变体在还原橙皮苷制备橙皮苷二氢查耳酮中的应用，其特征在于，所述烯醛还原酶突变体联合查耳酮异构酶突变体催化转化橙皮苷制备橙皮苷二氢查耳酮组合物。
4.一种三酶表达菌株，其特征在于，所述菌株是权利要求1所述的烯醛还原酶突变体、鼠李糖苷酶突变体、查耳酮异构酶突变体的质粒表达菌株；其中，所述查耳酮异构酶突变体的氨基酸序列为如SEQ ID NO：9所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述鼠李糖苷酶突变体的氨基酸序列为如SEQ ID NO：5所示的鼠李糖苷酶的第227位的色氨酸突变为异亮氨酸。
5.权利要求4所述的三酶表达菌株在制备橙皮苷二氢查耳酮组合物中的应用。
6.如权利要求5所述的三酶表达菌株在制备橙皮苷二氢查耳酮组合物中的应用，其
...【技术特征摘要】
1.一种烯醛还原酶突变体，其特征在于，所述烯醛还原酶突变体为氨基酸序列如seqid no：1所示的第662位的谷氨酰胺突变为半胱氨酸以及第462位的天冬氨酸突变为谷氨酸。
2.权利要求1所述的烯醛还原酶突变体在还原橙皮苷制备橙皮苷二氢查耳酮中的应用。
3.如权利要求2所述的烯醛还原酶突变体在还原橙皮苷制备橙皮苷二氢查耳酮中的应用，其特征在于，所述烯醛还原酶突变体联合查耳酮异构酶突变体催化转化橙皮苷制备橙皮苷二氢查耳酮组合物。
4.一种三酶表达菌株，其特征在于，所述菌株是权利要求1所述的烯醛还原酶突变体、鼠李糖苷酶突变体、查耳酮异构酶突变体的质粒表达菌株；其中，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：李荣旭，黄佳俊，周金林，林梓峰，许自豪，鲍雅丹，卢宇靖，
申请(专利权)人：广东金骏康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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