【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种种公牛冻精总rna的提取方法及不同活力精子pirna检测，具体为一种种公牛冻精总rna的提取方法及不同活力精子pirna检测和应用，属于分子育种技术应用领域。
技术介绍
1、在奶牛繁育中，选择优质种公牛冻精是提高母牛受胎率的关键因素。在种公牛选择指标中添加精液品质性状，可有效提高母牛繁殖效率，增加母牛和公牛的利用率。种公牛的精液品质性状主要包括射精量、鲜精活力、精子密度、冻精活力和精子畸形率等。这些精液指标的优劣能显著影响母牛的受胎率、输精指数、产犊间隔等关键的母牛繁殖指标。因此，提高种公牛精液品质性状是决定奶牛场经济效益的关键因素。
2、不同精液品质的牛精子中表现出不同的精子rna表达谱，随着高通量转录组测序技术的普及，通过分析精子中含有的rna成份差异有望成为一种评价精液品质的新方法。然而精子是一类高度分化的生殖细胞，精子中rna的含量很低，且因精子头部染色体高度浓缩，rna包裹在精子内部不易释放。因此，高质量提取精子rna是进一步探究精子功能的首要突破点。开发精子rna的高效高质量提取方法，有利于准确探索公牛精子功能相关rna的差异，以及对精液品质进行预测和准确评价等具有很大的应用价值。
3、在公牛精子rna中，pirna首次在果蝇睾丸组织中被发现的一类长度在26-33nt的核苷酸单链小rna，在机体中这类srna主要通过抑制基因的表达发挥作用。pirna主要起源于基因组的重复序列区域和转座子区域，与特异性蛋白piwi蛋白结合发挥作用，因此将此类srna称为pirna(piwi-i
技术实现思路
1、本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种种公牛冻精总rna的提取方法及不同活力精子pirna检测和应用。
2、本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的，一种种公牛冻精总rna的提取方法，包括以下步骤，
3、s1冻精的复苏和不同活力精子分离纯化
4、1)将种公牛冻精从液氮中取出，迅速置于38℃水浴中20s，迅速复苏，置于预热的1.5ml离心管中；
5、2)分别配置45％和90％的percoll溶液，配置percoll梯度溶液，即用9份percoll原液和1份1.5m的pbs配置100％的percoll溶液，再用0.15m的pbs将上述100％的percoll溶液分别稀释到45％和90％，将复苏后的冻精置于45％的percoll上层，室温1500rpm离心20min；
6、3)离心后，不同活力精子位于不同浓度的percoll溶液中，高活力精子位于90％percoll溶液中，而低活力精子位于45％percoll液层；
7、4)将分离的高低活力精子用预热的1×dpbs(dpbs表示的是杜氏改良pbs)溶液洗涤，清柔洗涤，1500rpm离心15min获得精子沉淀，区分高低活力精子；
8、5)用dpbs重复洗涤2遍,1500rpm离心15min，获得高低活力精子沉淀；
9、6)将精子沉淀用体细胞裂解液，室温裂解10min，去除残余体细胞，1500rpm离心10min，弃上清；
10、7)用无酶水配制的dpbs洗涤2遍，1500rpm离心10min，，进一步获得高活力和低活力精子沉淀；
11、s2精子rna提取及质量检测
12、1)用trizol重悬精子沉淀，添加100nm三(2-氯乙基)磷酸酯(tris(2-chloroethyl)phosphate，tcep)，70℃水浴30min，充分裂解精子；
13、2)加入0.2倍trizol体积的纯氯仿，剧烈震荡混匀15s，室温放置2-3min，之后再12000rpm 4℃离心15min；
14、3)离心后将上层水相转移至新的无rna酶的离心管中，加入等体积的无水乙醇，震荡混匀；
15、4)按照rna提取试剂盒说明书进行总rna的提取；
16、5)将提取的精子rna进行电泳检测分析，并评估精子rna质量。
17、优选地，所述体细胞裂解液包括0.1％ sds和1m tris-hcl，ph为7.3。
18、本专利技术还公开一种种公牛不同活力精子pirna检测方法，利用pirna转录组测序为基础的荧光定量分析来检测影响精子活力中的10种功能性pirna，主要包括以下步骤，
19、s1 rna样品检测按照agilent公司核酸检测手册进行，主要包括：
20、1)琼脂糖凝胶电泳分析rna降解程度；
21、2)nanodrop检测rna的纯度；
22、3)qubit对rna浓度进行精确定量；
23、4)agilent 2100精确检测rna的完整性；
24、s2构建pirna文库，将pirna添加接头后进行逆转录，获得测序文库；
25、s3使用hiseq/miseq测序平台进行pirna测序；
26、s4 pirna的分析；
27、通过对测序得到的pirna序列比对到pirna数据库进行已知pirna分析，对未知的pirna进行从头预测。
28、优选地，通过分析od260/280比值判断nanodrop检测rna的纯度。
29、优选地，所述pirna数据库网址为http://pirnabank.ibab.ac.in/。
30、优选地，使用茎环法逆转录合成pirna的cdna，通用茎环序列为：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac；pirna的逆转录引物如下所示：
31、
32、本专利技术还公开一种种公牛不同活力精子pirna检测方法的应用，包括用于评价公牛精子活力的功能性差异表达pirna以及分析不同活力精子中pirna组合表达。
33、优选地，采用实时荧光定量pcr分析不同活力精子中pirna组合表达，实时荧光定量pcr20μl反应体系为：10μl的2×real-time pcr master mix，正、反向引物各0.5μl，cdna1μl，8μl h2o；反应条件为：95℃3min；95℃，15s，57℃，15s，72℃，20s，40个循环。
34、优选地，所述实时荧光定量pcr检测中所使用的上游引物为的特异性引物,下游引物为根据茎环序列设计的通用下游引物：5’—agtgcagggtccgaggtatt--3'。
35、优选地，所述特异性荧光定本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种种公牛冻精总RNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的一种种公牛冻精总RNA的提取方法，其特征在于：所述体细胞裂解液包括0.1％SDS和1M Tris-HCl，pH为7.3。
3.一种种公牛不同活力精子piRNA检测方法，其特征在于：利用piRNA转录组测序为基础的荧光定量分析来检测影响精子活力中的10种功能性piRNA，主要包括以下步骤，
4.根据权利要求3所述的一种种公牛不同活力精子piRNA检测方法，其特征在于：通过分析OD260/280比值判断Nanodrop检测RNA的纯度。
5.根据权利要求3所述的一种种公牛不同活力精子piRNA检测方法，其特征在于：所述piRNA数据库网址为http://pirnabank.ibab.ac.in/。
6.根据权利要求3所述的一种种公牛不同活力精子piRNA检测方法，其特征在于：使用茎环法逆转录合成piRNA的cDNA，通用茎环序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC；piRNA的逆转
7.一种种公牛不同活力精子piRNA检测方法的应用，其特征在于：包括用于评价公牛精子活力的功能性差异表达piRNA以及分析不同活力精子中piRNA组合表达。
8.根据权利要求7所述的一种种公牛不同活力精子piRNA检测方法的应用，其特征在于：采用实时荧光定量PCR分析不同活力精子中piRNA组合表达，实时荧光定量PCR 20μL反应体系为：10μL的2×Real-time PCR Master Mix，正、反向引物各0.5μL，cDNA 1μL，8μLH2O；反应条件为：95℃3min；95℃，15s，57℃，15s，72℃，20s，40个循环。
9.根据权利要求8所述的一种种公牛不同活力精子piRNA检测方法的应用，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测中所使用的上游引物为的特异性引物,下游引物为根据茎环序列设计的通用下游引物：5’—AGTGCAGGGTCCGAGGTATT--3'。
10.根据权利要求9所述的一种种公牛不同活力精子piRNA检测方法的应用，其特征在于：所述特异性荧光定量引物序列如下：
...【技术特征摘要】
1.一种种公牛冻精总rna的提取方法，其特征在于：包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的一种种公牛冻精总rna的提取方法，其特征在于：所述体细胞裂解液包括0.1％sds和1m tris-hcl，ph为7.3。
3.一种种公牛不同活力精子pirna检测方法，其特征在于：利用pirna转录组测序为基础的荧光定量分析来检测影响精子活力中的10种功能性pirna，主要包括以下步骤，
4.根据权利要求3所述的一种种公牛不同活力精子pirna检测方法，其特征在于：通过分析od260/280比值判断nanodrop检测rna的纯度。
5.根据权利要求3所述的一种种公牛不同活力精子pirna检测方法，其特征在于：所述pirna数据库网址为http://pirnabank.ibab.ac.in/。
6.根据权利要求3所述的一种种公牛不同活力精子pirna检测方法，其特征在于：使用茎环法逆转录合成pirna的cdna，通用茎环序列为：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgac；pirna...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁强，王慧利，赵芳，陈坤琳，夏淑雯，沈阳阳，崔兆康，钱勇，仲跻峰，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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