本发明专利技术涉及生产具有蛋白质／多肽载体分子的肽免疫原结合物的方法，所述蛋白质／多肽载体分子可有效用作免疫原，其中肽免疫原通过载体或任选连接的接头分子的氨基酸残基上的活化官能团结合到蛋白质载体上，其中氨基酸残基上任何未结合的活性官能团通过加帽而失活，从而维持载体分子的免疫功能，但降低发生使结合物安全性或效果降低的不希望的反应的倾向。此外，本发明专利技术还涉及这样的免疫原性产品和含有通过这种方法制备的这种免疫原性产品的免疫原性组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求根据35 U.S.C.§119(e)在2003年12月17日提交的美国临时专利申请60/530,480的优先权，其在此整体引入作为参考。
技术介绍
适应性免疫的实质是生物体对存在对外来物质作出反应和产生能够与宿主特异性相互作用并保护宿主免受侵害的组分(抗体和细胞)。“抗原“或“免疫原”是能引发此类免疫应答以及能够与致敏细胞和产生的针对该抗原的抗体相互作用的物质。抗原或免疫原通常是包含被免疫系统的各种组分识别和与之相互作用的独特抗原性位点或“抗原表位”的大分子。它们可以作为单独的分子存在，所述分子由合成的有机化学产物、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、RNA、DNA或多糖组成；或者可以是细胞结构(细菌或真菌)或病毒的部分(Harlow和泳道1988 a，b，c；Male等，1987)。小分子样短肽，尽管通常能与免疫应答的产物相互作用，通常不能独自引起应答。这些肽免疫原或“半抗原”如它们的名称一样，实际上是不完全的抗原，并且，尽管不能够单独导致免疫原性或引发抗体产生，但是它们可以通过与合适的载体连接而产生免疫原性。载体通常是高分子量蛋白质抗原，当体内施用后能引起免疫应答。在免疫应答中，抗体由B-淋巴细胞连同T-辅助(TH)细胞产生和分泌。在大多数半抗原载体系统中，B-细胞产生对半抗原和载体具有特异性的抗体。在这些情况下，所述T淋巴细胞具有对载体的特异性结合结构域，但是不能单独识别半抗原。以一种协同作用，B和T-细胞协作诱发半抗原特异性抗体应答。在发生这样的免疫应答后，如果宿主随后仅被所述半抗原攻击，通常其应答方式为从首次免疫后形成的记忆细胞产生半抗原特异性抗体。模拟较大的大分子上一些关键的表位结构的合成半抗原通常结合到载体以产生对更大“母体”分子的免疫应答。例如，短肽片段可以从蛋白质的已知序列合成并连结到载体以诱导针对天然蛋白质的免疫原性。此类产生免疫原的合成方法已成为许多当前疫苗制造研究的基础。然而，在许多情况下，仅仅通过使用合成肽载体结合物产生B-细胞应答不能总是保证对于完整抗原的保护性免疫，尽管设计得非常好。通过来自较大的病毒颗粒或细菌细胞的短肽抗原表位产生的免疫应答可能只够产生B-细胞水平的记忆。在这些情况下，目前通常认为细胞毒性T-细胞应答是保护性免疫更重要的指示。设计具有用于B-细胞和T-细胞识别的合适表位结合位点的肽免疫原是当今免疫学最具挑战性的研究领域之一。通过将较小或免疫原性差的分子结合到较大的“载体”分子以增加这些分子的免疫原性的方法已经成功使用了几十年(参见，例如Goebel等(1939)J.Exp.Med.6953)。例如，已经描述许多免疫原性组合物，其中纯化的荚膜聚合物与载体蛋白结合以通过利用这种“载体效应”产生更有效的免疫原性组合物，Schneerson等(1984)Infect.Immun.45582-591)。结合作用还显示规避通常用自由多糖免疫婴儿时观察到的较弱的抗体应答(Anderson等(1985)J.Pediatr.107346；Insel等(1986)J.Exp.Med.158294)。使用各种交联/结合试剂比如同型双功能，异型双功能，或零长度交叉接头已经成功产生了半抗原-载体结合物。许多这样的方法目前可适用于糖类、蛋白质和肽与肽载体的结合。大多数的方法产生胺、酰胺、氨基甲酸乙酯、异硫脲或二硫键或有时产生硫醚。使用结合试剂的缺点是活性部位如果不被中和则自由地与任何不需要的分子体外(从而对结合物的功能或稳定性造成负面影响)或者体内(从而对用该制剂免疫的人或动物带来负面事件的潜在危险)反应，所述结合试剂向载体和/或半抗原分子上活性的氨基酸分子侧链引入活性部位。这种过量的活性部位可以利用各种已知的化学反应进行反应或“加帽”以使这些位点失活，但是这些反应可能破坏结合物的功能。当试图通过将活性部位引入载体分子中时可能特别成问题，因为其较大和更复杂的结构(相对于半抗原)可能使其对于化学处理的破坏性作用更敏感。事实上，还没有通过如下方法制备结合物的已知实例首先活化载体，然后在结合反应中与半抗原反应，最后对剩余的活性部位“加帽”，同时保留所得到的结合物作为具有所需的“载体效应”性质的免疫原性组合物的能力。专利技术概述本专利技术涉及生产肽免疫原与蛋白质/多肽载体的免疫原性结合物的方法，其中所述肽免疫原通过载体氨基酸残基比如赖氨酸残基的衍生官能团结合到载体，其中氨基酸残基任何未结合的衍生的官能团通过加帽而失活以阻止它们与其它的分子，包括蛋白质/多肽的反应从而保留载体的功能，使其维持其引发针对肽免疫原的所需的免疫应答，没有载体则不会产生该免疫应答。此外，本专利技术还涉及通过上述方法制备的结合物和含有这种结合物的免疫原性组合物。在一个实施方案中，本专利技术涉及用于通过肽免疫原的氨基酸残基的活性基团将肽免疫原与具有一种或者多种官能团的蛋白质/多肽载体结合的第一种方法，所述方法包括以下步骤(a)衍生蛋白质/多肽载体的一个或者多个官能团以产生具有活性位点的衍生化分子；(b)使步骤(a)的衍生化的蛋白质/多肽载体与肽免疫原的氨基酸残基的活性基团在满足以下情况的反应条件下反应使肽免疫原与衍生的蛋白质/多肽载体经官能团结合；和(c)进一步将结合物与加帽试剂反应以使活化的蛋白质/多肽载体上的自由活性官能团失活，从而保留载体针对肽免疫原的官能度，没有载体则不会产生这一官能度。在一个实施方案中，所述蛋白质/多肽载体选自人血清白蛋白，匙孔-血蓝蛋白，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白，流感血凝素，PAN-DR结合肽(PADRE多肽)，疟原虫环子孢子(CS)蛋白，乙型肝炎B表面抗原(HBsAg19-28)，热休克蛋白(HSP)65，CalmetteGuerin(BCG)，霍乱毒素，减毒的霍乱毒素突变体，白喉毒素，与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白，重组链球菌C5a肽酶，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)ORF 1224，化脓链球菌ORF 1664，化脓链球菌ORF 2452，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)ORF T367，肺炎衣原体ORF T858，破伤风类毒素，HIV gp 120 T1，识别粘性基质分子的微生物表面组分(MSCRAMMS)，生长因子/激素，细胞因子和趋化因子。在另一实施方案中，所述蛋白质/多肽载体包含T-细胞抗原表位。在另一实施方案中，所述蛋白质/多肽载体是细菌类毒素，比如上述的破伤风类毒素，霍乱毒素或霍乱菌毒素突变体。在优选实施方案中，所述蛋白质/多肽载体是CRM197。在另一实施方案中，所述蛋白质/多肽载体可以是流感血凝素，PADRE多肽，疟疾CS蛋白，乙型肝炎表面抗原(HSBAg19-28)，热休克蛋白65(HSP 65)，或来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(BCG)的多肽。在优选实施方案中，所述蛋白质/多肽载体选自链球菌的rC5a肽酶，化脓链球菌ORF 1224，化脓链球菌ORF 1664或化脓链球菌ORF2452，肺炎衣原体ORF T367和肺炎衣原体ORF T858。在一个实施方案中，蛋白质/多肽载体是生长因子或激素，其刺激或增强免疫应答，并选自IL-1，IL-2，γ-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种通过肽免疫原的氨基酸残基的活性基团将肽免疫原与具有一个或多个官能团的蛋白质／多肽载体结合的方法，该方法包括以下步骤：（ａ）衍生蛋白质／多肽载体的一个或多个官能团或任选衍生连接于蛋白质／多肽载体的多肽接头的一个或多个官能团，以产生具有活性位点的衍生的载体；（ｂ）将步骤（ａ）的衍生的蛋白质／多肽载体与肽免疫原的氨基酸的活性基团在使肽免疫原通过官能团与衍生的蛋白质／多肽载体结合的反应条件下进行反应；和（ｃ）另外将结合物与加帽试剂反应以使衍生的蛋白质／多肽载体上自由活性的未反应的官能团失活，从而保留载体的官能度，以便保持其引发所需的针对肽免疫原的免疫应答的能力，这种免疫应答在没有载体时不会发生。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：拉萨帕G阿鲁穆格哈姆，A克利须那普拉萨德，
申请(专利权)人：惠氏公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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