【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测mrna产品中具有poly a尾的mrna的比例的方法，可应用在mrna产品的质量控制等领域。
技术介绍
1、2020年两款mrna疫苗的上市宣告mrna技术正式进入商业时代，同时mrna也进入了快速发展的阶段。mrna作为药物和疫苗的技术基础，在生产和应用方面具有很大的灵活性。任何蛋白质都可以通过mrna编码和表达，原则上可以开发预防性和治疗性疫苗，对抗各种疾病，如感染和癌症，以及蛋白质替代疗法。
2、mrna产品的制备流程大致可以分为三个阶段：1)线性dna制备，这一阶段主要包括构建含有目的基因的载体、通过工程菌进行质粒扩增以及dna的线性化；2)mrna原液制备，这一阶段主要通过体外转录技术以上一阶段的线性dna为模板制备mrna，此阶段制备的mrna结构中包含5’端加帽结构和3’端poly a加尾结构；3)脂质体包封，这一阶段采用不同技术将mrna与纳米递送材料通过自组装形成纳米离子，经浓缩、纯化及无菌过滤后进行灌装。3’端poly a是mrna分子结构的3’末端添加的非模板化腺苷，在mrna的翻译和稳定性中起到关键作用。因此需要对具有poly a尾的完整mrna比例进行检测确保mrna的产品质量。
3、目前常用的对核酸检测方法主要有两种：实时定量pcr检测法及数字pcr检测法，其中数字pcr检测方法在定量检测拷贝数时准确度更高，且因其不需要设计或制备任何标准曲线而更加方便。目前的数字pcr技术以微腔室/微孔或微滴作为pcr反应器，使模板在微孔或微滴中随机分布，在使用热循环仪
技术实现思路
1、本专利技术提供一种检测mrna产品中具有poly a尾的mrna的比例的方法，其中，包括以下步骤：
2、1)得到3’端带有接头的rna；
3、2)反转录得到cdna；反转录的引物是根据接头的序列设计的；
4、3)针对cdna的5’端分别设计合成引物和探针，以及，针对cdna的3’端分别设计合成引物和探针，配制数字pcr反应体系进行测定。所述针对cdna的5’端分别设计合成引物和探针，是用以作为内参；所述针对cdna的3’端分别设计合成引物和探针，是用以检测poly a尾信号。内参是在实际检测中，根据需要指定的，不同的待检测rna的内参不必相同。本专利技术在检测中，将同时具有5’端和3’端信号的片段定义为完整序列。通过对引物进行针对性的设计，本专利技术亦可以检测含有不完整的poly a的rna的比例。本专利技术对待检测rna的poly a的长度没有限制。
5、优选地，所述方法还包括根据数字pcr测定的拷贝数计算具有poly a尾的mrna的比例。优选地，具有poly a尾的mrna的比例为：同时具有poly a和内参基因信号的拷贝数/内参基因拷贝数×100％。
6、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述方法还包括连接mrna与接头以得到所述的3’端带有接头的rna的过程；
7、优选地，所述mrna与接头的摩尔比为1:5-20。
8、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述方法还包括纯化，所述3’端带有接头的rna为纯化后的rna。
9、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述对rna分子进行反转录的步骤还包括将纯化后的mrna用特异性引物进行反转录。
10、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述配制数字pcr反应体系的步骤还包括将cdna进行纯度和浓度分析后进行适当的稀释。
11、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述的接头的5’端带有一个或两个以上的磷酸化修饰；
12、优选地，所述的接头的3’端带有一个或两个以上的ddc标记。5’磷酸化修饰使接头能够和mrna的3’端连接，3’ddc标记确保mrna不会和接头的3’端连接。
13、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述探针是经荧光基团修饰的，所述修饰包括：
14、探针的5’端碱基采用荧光报告基团修饰，同时探针的3’端碱基采用荧光淬灭基团修饰。
15、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述的针对cdna的5’端设计的正向引物的序列为：5’-tgtttgtgttcctggtgctg-3’(seq id no.1)；
16、优选地，所述的针对cdna的5’端设计的反向引物的序列为：5’-cggagctcctgaacacctta-3’(seq id no.2)；
17、优选地，所述的针对cdna的5’端设计的探针的序列为：5’actccttcacccgcggcgtgt-3’(seq id no.3)；
18、优选地，所述的针对cdna的3’端设计的正向引物的序列为：5’-cttgccttctggccatgc-3’(seq id no.4)；
19、优选地，所述的针对cdna的3’端设计的反向引物的序列为：5’-agtcatatgctttttttttt-3’(seq id no.5)；
20、优选地，所述的针对cdna的3’端设计的探针的序列为：5’-ccttgcacctgtacctcttggtcttt-3’(seq id no.6)。
21、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述的针对cdna的5’端设计的探针的5’端带有vic修饰；所述的针对cdna的5’端设计的探针的3’端带有bhq-1修饰；
22、优选地，所述的针对cdna的3’端设计的探针的5’端带有fam修饰；所述的针对cdna的3’端设计的探针的3’端带有bhq-1修饰。
23、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述的接头的序列包括如seq id no.7所示的序列：seq id no.7：5’-tcgtatgccgtcttctgcttg-3’。
24、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述反转录的引物的序列包括如seq id no.8所示的序列，seq id no.8：5’-agcagaagacggcatacga-3’。
25、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述数字pcr为滴定式数字pcr；
26、优选地，所述数字pcr为双重探针数字pcr。
27、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述连接反应的程序为：
28、将mrna产品在60-80℃变性10分钟后迅速置于冰上冷却；
29、将配好的连接体系在25℃孵育2-6小时。
30、根据本专利技术的具体实施方案，其中，所述的数字pcr反应步骤包括：
31、1)95℃预变性2-5分钟，1个循环；
32、2)95℃变性5-60本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测mRNA产品中具有poly A尾的mRNA的比例的方法，该方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括根据数字PCR测定的拷贝数计算具有poly A尾的mRNA的比例。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还包括连接mRNA与接头以得到所述的3’端带有接头的RNA的过程。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述的接头的5’端带有一个或两个以上的磷酸化修饰；优选地，所述的接头的3’端带有一个或两个以上的ddC标记。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述探针是经荧光基团修饰的，所述修饰包括：
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述的针对cDNA的5’端设计的探针的5’端带有VIC修饰；所述的针对cDNA的5’端设计的探针的3’端带有BHQ-1修饰；
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中，所述的接头的序列包括如SEQ IDNO.7所示的序列，SEQ ID NO.7：5’-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’。
...【技术特征摘要】
1.一种检测mrna产品中具有poly a尾的mrna的比例的方法，该方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括根据数字pcr测定的拷贝数计算具有poly a尾的mrna的比例。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还包括连接mrna与接头以得到所述的3’端带有接头的rna的过程。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，所述的接头的5’端带有一个或两个以上的磷酸化修饰；优选地，所述的接头的3’端带有一个或两个以上的ddc标记。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述探针是经荧光基团修饰的，所述修饰包括：
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述的针对cdna的5’端设计的探针的5’端带有vic修饰；所述的针...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡勇，汤赞，王瑞钥，徐连强，王帅，
申请(专利权)人：深圳瑞吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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