一种抑制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药品的制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药类，具体是一种抑制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药品的制造方法，其特征在于：根据猪繁殖与呼吸道综合症病毒（ＰＲＲＳＶ）和猪圆环病毒（ＰＣＶ－２）序列，分别找到参与ＰＲＲＳＶ和ＰＣＶ－２复制酶的基因；设计引物，通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）的方法扩增该基因片段，再将该基因片段克隆到专用的质粒ＤＮＡ载体中，同时还在质粒ＤＮＡ中插入了细胞转导肽基因片段，即可制得抑制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药品的制造方法，该药品能靶向性的将质粒ＤＮＡ导入到病毒复制的部位。本发明专利技术应用了ＲＮＡ沉默技术，作为新的有效抗病毒工具，其机制与建立在病毒蛋白基础上的传统的疫苗机制不同，是转录后ＭＲＮＡ水平上的基因沉默机制，通过双链ＲＮＡ分子阻断病毒复制关键酶基因的表达而达到抑制病毒复制的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药类，具体是一种抑制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药品的制备方 法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸道综合症(porcine reproductive and respiratory syndrome，简 称PRRS)是猪的重要传染性疾病。该病有许多的临床症状，以母猪流产和各年龄段猪呼吸 困难最为典型，1992年国际兽医局(OIE)将该病列为B类传染病。猪繁殖与呼吸道综合症 病毒(PRRSV，俗称猪蓝耳病毒)是引起PRRS的原发病原，由于PRRSV具有抗原变异性、嗜巨 噬细胞性、抗体依耐性增强作用等特征，临床上常引起免疫应答差、持续感染、混合感染，但 该病的致病机理和免疫机理尚不清楚，给养猪业造成了巨大经济损失。猪断奶后多系统衰竭综合症(Postweaning muitisystemic wasting syndrome, 简称PMWS)是近年来被发现和认识的又一种重要的猪传染病。PMWS主要侵害5 12周龄 的仔猪，以进行性消瘦，生长发育迟缓，皮肤苍白，和多系统病理损伤为特征。近年来，该病 的流行呈上升的趋势，给中国的养猪业造成了相当大的经济损失，严重威胁着养猪业的发 展。目前已经确认，猪圆环病毒2型(PCV-2)是引起PMWS的原发病原。现在，猪蓝耳病毒和圆环病毒已成为制约我国养猪业发展的最重要病毒性疾病， 目前还没有一种科学、有效、安全的控制方法。传统控制PRRSV和PCV-2病毒的方法及缺点如下表3
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，公开一种抑制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药 品的制备方法，该药品能科学、有效、安全地控制和治疗猪繁殖与呼吸道综合症、猪断奶后多系统衰竭综合症。本专利技术的技术方案如下一种抑制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药品的制造方法，其特征在于根据猪繁殖与 呼吸道综合症病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV-2)序列，分别找到参与PRRSV和PCV-2复制 酶的基因；设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)的方法扩增该基因片段，再将该基因片段 克隆到专用的质粒DNA载体中，同时在质粒DNA中插入了细胞转导肽基因片段，即可制得抑 制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药品，该药品能靶向性的将质粒DNA导入到病毒复制的部位。本专利技术为了提高转染效率，将壳聚糖与质粒DNA结合，形成纳米颗粒，从而使质粒 DNA能够快速进入机体的肺泡巨噬细胞，有效抑制猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PRRSV)和 猪圆环病毒(PCV-2)的复制。本专利技术作用机理大量制备的质粒DNA进入机体后，激活体内的内切酶，加入的小 分子RNA被切割为21 23核苷酸的小干扰RNA(siRNA)，siRNA双链结合一个核酶复合物 从而形成RNA诱导的沉默复合体。在ATP存在时，依耐于ATP的解旋酶解开双链的siRNA， 通过碱基互补原则反义siRNA链特异性识别蓝耳病毒和圆环病毒复制酶基因MRNA，然后由 活化的RNA诱导的沉默复合体(RISC)，在互补区距离siRNA反义链3’末端约12个碱基的 位置切割蓝耳病和圆环病毒复制的酶的基因，使病毒不能复制。本专利技术应用了 RNA沉默技术，作为新的有效抗病毒工具，其机制与建立在病毒蛋 白基础上的传统的疫苗机制不同，是转录后MRNA水平上的基因沉默机制，通过双链RNA分 子阻断病毒复制关键酶基因的表达而达到抑制病毒复制的效果。实施例，具体方法是A、根据Genebank上发布的猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PRRSV)和猪圆环病毒 (PCV-2)序列，分别找到参与PRRSV和PCV-2复制酶的基因；B、设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)的方法扩增该基因片段；C、将该基因片段克隆到专用的质粒DNA载体中；D、在质粒DNA中插入了细胞转导肽基因片段；E、将壳聚糖与质粒DNA结合，形成纳米颗粒.根据本专利技术方法制得的抑制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药品的使用方法(一)、作为预防时建议猪场所有猪注射2次，这样能够快速降低猪群中蓝耳病毒和圆环病毒的数 量，促进大群稳定。具体如下公猪、母猪5ml/头，断奶前仔猪Iml/头，断奶后仔猪2ml/头，小猪阶段3ml/头， 中大猪3 4ml/头，间隔15天按以上剂量再全部注射一次；两次注射结束之后，母猪、公 猪每隔3个月注射一次，每次5ml/头，仔猪出生后第15天，注射Iml/头，30日龄时打注射 2ml/头。按照上述方法使用，能够有效预防蓝耳病和圆环病毒病的发生。(二)、作为治疗时当猪场发生蓝耳病和圆环病毒病后，第一天注射圆蓝多抗，剂量按公猪、母猪5ml/头，断奶前仔猪Iml/头，断奶后仔猪2ml/头，小猪阶段3ml/头，中大猪3 4ml/头，同时 注意使用抗生素控制继发的细菌感染。第五天时，再按上述剂量注射一次圆蓝多抗。坚持 以上方案进行治疗，经过15天后，对蓝耳病、圆环病毒病和细菌引起的混合感染有极好的 效果，治愈率达到90%以上。(三)、作为疫苗时选择20头IOkg左右小猪，通过对血液进行PRRSV及PCV-2的PCR检测都为阴性， 平均分为试验组及对照组各4头，在同一条件下，分开饲喂。保护性实验结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药品的制备方法，其特征在于：根据ＰＲＲＳＶ和ＰＣＶ－２序列，分别找到参与ＰＲＲＳＶ和ＰＣＶ－２复制酶的基因；设计引物，通过聚合酶链式反应的方法扩增该基因片段，再将该基因片段克隆到专用的质粒ＤＮＡ载体中，同时在质粒ＤＮＡ中插入了细胞转导肽基因片段，即可制得抑制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药品。

【技术特征摘要】
一种抑制猪蓝耳病毒及圆环病毒的药品的制备方法，其特征在于根据PRRSV和PCV 2序列，分别找到参与PRRSV和PCV 2复制酶的基因；设计引物，通过聚合酶链式反应的方法扩增该基因片段，再将该基因片段克隆到专用的质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建军，陶增思，舒鑫标，施伟领，刘文峰，彭俊平，
申请(专利权)人：浙江大飞龙动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]