家蚕血液型脓病病源ＢｍＮＰＶ直接ＰＣＲ检测法制造技术

本发明专利技术公开了一种家蚕血液型脓病病源ＢｍＮＰＶ直接ＰＣＲ检测法，其检测方法首先对染病家蚕的血液通过乙醇沉淀法进行处理，去除ＰＣＲ反应抑制物；根据家蚕血液型脓病病源ＢｍＮＰＶ的基因组分析，设计多角体蛋白基因ＰＣＲ引物；对多角体蛋白基因进行ＰＣＲ扩增，反应体系中加入了抗ＰＣＲ反应抑制物ＢＳＡ，同时以家蚕线粒体ＣＯＩ基因的引物进行ＰＣＲ反应做阳性对照；分别取正常家蚕血液和感染了白僵病、绿僵病、细菌病、微孢子病的家蚕的染病中肠，进行ＰＣＲ反应的特异性分析；琼脂糖胶电泳检测上述ＰＣＲ反应结果。整个检测过程操作简单，仅４个小时就可完成。应用本发明专利技术定期抽样检测，可以在ＢｍＮＰＶ感染早期对疾病进行诊断，及时采取措施预防疾病的发生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及由家蚕核型多角体病毒BmNPV引起的家蚕血液型脓病的早期分子生 物学诊断技术，属家蚕蚕病防治生物

技术介绍
家蚕是有重要经济价值的鳞翅目昆虫，在国际市场上，我国生丝出口占世界生丝 出口总量的90%以上，绸缎出口占50%以上，丝绸服装出口也占相当大的比重。家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是一种环状双链DNA，由其引起的家蚕核型多角体 病是茧丝生产中最重要的病害，该病传染性极强，难以控制。每年全国蚕桑生产因蚕病的损 失占到总产量的30%，其中70%由核型多角体病毒(BmNPV)引起。该病在各龄幼虫、蛹、成虫 期均可发生，每年都有5-20%的发病率，严重时可达到50%。目前我国还没有对BmNPV引起 的疾病进行早期规范化的诊断技术，生产上主要依靠病症来进行诊断，即在发病中后期才 可以诊断，而此时病蚕已不可用药物治疗，严重影响了蚕农的生产积极性和蚕桑产业的发 展。基于PCR的诊断技术已经在疾病的诊断中发挥了重要的作用，它具有快速、灵敏、 准确的特点，并已在人类的一些由病原微生物引起的疾病如HIV、SARS等中得到广泛应用。 染病家蚕血细胞中BmNPV多角体(occlusion bodies, OBs)最早是在1856年由Maestri和 Cornalia分别利用光学显微镜观察观察到的，这也是目前大多数检测NPV的方法，其最低 检测水平为IO6个多角体。杂交能检测到20 5000 PIBsCO. 1 ng DNA)，但该方法技术操 作十分复杂，严重限制了其在疾病诊断中的应用。本专利技术方法提取病蚕血液的基因组DNA， 利用PCR的方法则可检测到1 5fg的病毒DNA，(Ifg=Kr6ng=IO-15 g)，灵敏度远高于前两 种方法，在幼虫感染两天就可检测到。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种快速、灵敏和特异性强的早期防治家蚕重大病害BmNPV 病原检测方法。本专利技术的实现过程如下一种家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法，检测步骤如下 (1)对染病家蚕的血液通过乙醇沉淀法进行处理，去除PCR反应抑制物， 酒精擦拭染病家蚕体表，以防污染影响实验结果，取IOul家蚕血液到1. 5mL离心管中， 加入0. 5mL 75%乙醇，涡旋Imin后，10 000 rpm离心1分钟，倒去上清，空气中干燥5min， 以去除乙醇残留，加入50 ul TE，充分溶解；(2 )根据家蚕血液型脓病病源BmNPV的基因组分析，设计多角体蛋白基因 (polyhedron, polh) PCR 弓丨物，引物序列为polhf :ATGCCGAATTATTCATACACCCCPolhr TAATACGCCGGACCAGTGAACAG(3)对多角体蛋白基因进行PCR扩增，反应体系中加入了抗PCR反应抑制物BSA，同时 以家蚕线粒体COI基因的引物进行PCR反应做阳性对照；(4)分别取正常家蚕血液和感染了白僵病、绿僵病、细菌病、微孢子病的家蚕的染病中 肠，进行PCR反应的特异性分析；(5)琼脂糖胶电泳检测上述PCR反应结果。本专利技术的优点与积极效果本专利技术检测方法简易的、易于规模化、低成本，直接利 用家蚕组织进行PCR检查BmNPV技术，与现有技术相比具有如下优点(1)由于血液中含有大量的PCR反应抑制物，不能直接进行检测，因此传统的基于PCR 的检测需要从血液中纯化病菌的DNA。该方法操作繁琐，不利于规模化应用，现有的技术也 未曾提供不通过纯化家蚕的血液DNA进行BmNPV检测的方法。本专利技术省却了染病家蚕组织 的DNA提取过程，能够缩短诊断过程，降低诊断成本，加快PCR技术在蚕病诊断上的应用。(2)以往基于PCR检测BmNPV的方法，设计的PCR扩增引物多为BmNPV功能基因上 的一段核酸序列，未考虑其与家蚕基因组序列的相似性。而本专利技术的引物序列充分考虑了 BmNPV基因组序列和家蚕基因组序列的相似性，选取BmNPV基因组的特异序列，即杆状病毒 的多角体蛋白基因的编码序列作为扩增的目的条带，减少了疾病检测中的假阳性，同时本 专利技术运用鳞翅目昆虫线粒体CO I基因通用的扩增引物作为对照，能够避免疾病检测中的假 阴性。(3)本方法操作简单，可以避免在DNA提取过程中人为造成的污染。灵敏度高，可 以检测BmNPV感染初期的病蚕，进行人为添食两天后的家蚕即可检测到BmNPV的感染，成本 低，特异性强，运用本方法定期抽样检测大规模饲养的家常可以在BmNPV感染早期发现病 情，对疾病进行早期诊断，及时采取措施以预防疾病的爆发。附图说明图1为家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法的特异性验证一与其它蚕病的 对照；图2为家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法的灵敏度检测； 图3为家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法的应用实例1 ； 图4家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法的应用实例2。具体实施例方式家蚕组织直接PCR检测家蚕血液型脓病病源BmNPV，其特征在于检测步骤如下 第一、对染病家蚕的血液进行处理，去除PCR反应抑制物酒精擦拭染病家蚕体表，以防污染影响实验结果，取IOul家蚕血液到1. 5mL离心管中， 加入0. 5mL 75%乙醇，涡旋Imin后，10 000 rpm离心1分钟，倒去上清，空气中干燥5min， 以去除乙醇残留，加入50 ul TE，充分溶解。第二、对家蚕血液型脓病病源BmNPV的基因组分析发现，多角体蛋白基因 (polyhedron, polh)为杆状病毒所特有，具有较高的特异性，该基因序列长为738 bp，编码246个氨基酸，预测分子量为28.85 kda。根据polh基因的序列和和已经完成的家蚕 基因组序列分析发现，该基因与家蚕基因组同源性不高，理论上能够在存在家蚕基因组的 情况下进行Polh基因的特异性扩增。即能够进行家蚕组织直接PCR检测家蚕血液型脓病 病源 BmNPV。设计引物序列为polhf :ATGCCGAATTATTCATACACCCC poIhr TAATACGCCGGACCAGTGAACAG 第三、进行PCR检测PCR 反应体系均为 25 ul，含 KCl 50 mM, Tris (pH 8.3) 10 mM, MgCl2 1.5 mM, dNTPs 200 uM(每种)，扩增引物 0.4 uM(每种)，Taq DNA polymerase 1 单位，BSA 0.1 ug/uL， DNA模版2 uL，ddH20(pH 7.0)补充至总体积25 uL。该反应体系与常规PCR反应体系相 比，其中加入了抗PCR反应抑制物BSA。扩增条件为95 °C预变性5 min ；94 °C变性30 s ；55 °C退火45 s ；72 °C延伸55 s，30个循环后72 °C终延伸10 min。同时以家蚕COI基因的引物进行PCR反应做阳性对照。引物序列为LYQ3 :CCTGGATCTTTAATTGGAGA LYQ4 :GGTAAAATTAAAATATAAACTTC第四、分别取正常家蚕血液和感染了白僵病、绿僵病、细菌病、微孢子病家蚕的染病中 肠，通过前述同样的处理，去除PCR反应抑制物，进行反应的特异性分析。第五、电泳检测扩增产物用2%的琼脂糖胶电泳，1%的溴化乙锭染色后，紫外灯照本文档来自技高网...

【技术保护点】
家蚕血液型脓病病源ＢｍＮＰＶ直接ＰＣＲ检测法，其特征在于检测步骤如下：　　（１）对染病家蚕的血液通过乙醇沉淀法进行处理，去除ＰＣＲ反应抑制物；　　（２）根据家蚕血液型脓病病源ＢｍＮＰＶ的基因组分析，设计多角体蛋白基因（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ，ｐｏｌｈ）　ＰＣＲ引物，　　引物序列为：ｐｏｌｈｆ：ＡＴＧＣＣＧＡＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＣＡＣＣＣＣ　　ｐｏｌｈｒ：ＴＡＡＴＡＣＧＣＣＧＧＡＣＣＡＧＴＧＡＡＣＡＧ　　（３）对多角体蛋白基因进行ＰＣＲ扩增，反应体系中加入了抗ＰＣＲ反应抑制物ＢＳＡ，同时以家蚕线粒体ＣＯＩ基因的引物进行ＰＣＲ反应做阳性对照；　　（４）分别取正常家蚕血液和感染了白僵病、绿僵病、细菌病、微孢子病的家蚕的染病中肠，进行ＰＣＲ反应的特异性分析；　　（５）琼脂糖胶电泳检测上述ＰＣＲ反应结果。

【技术特征摘要】
家蚕血液型脓病病源BmNPV直接PCR检测法，其特征在于检测步骤如下(1)对染病家蚕的血液通过乙醇沉淀法进行处理，去除PCR反应抑制物；(2)根据家蚕血液型脓病病源BmNPV的基因组分析，设计多角体蛋白基因 (polyhedron, polh) PCR引物，引物序列为polhfATGCCGAATTATTCATACACCCCpolhr...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨金宏，孔卫青，王代钢，
申请(专利权)人：安康学院，
类型：发明
国别省市：61[中国|陕西]