本发明专利技术提供了一种啤酒酵母工程菌，出发菌株为酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ?ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），该酿酒酵母染色体上的ＰＥＰ４基因部分或全部被重组序列替换而破环，所述的重组序列包括β－葡聚糖酶基因表达单元。本发明专利技术啤酒酵母工程菌通过将外源β－葡聚糖酶基因表达单元通过同源重组技术将工业酿酒酵母染色体上ＰＥＰ４基因的部分序列或全部序列替换，蛋白酶Ａ活性显著降低，而能稳定表达β－葡聚糖酶。该构建的啤酒酵母工程菌不仅遗传稳定性良好，而且具有优于出发菌株的啤酒酿造品质，啤酒泡沫稳定性和β－葡聚糖降解率提高，啤酒过滤速度改善，而且生理性能和生化特性并无明显差异。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及啤酒酿造
，尤其涉及一种可改善啤酒起泡性能的啤酒酵母工 程菌及其制备方法和应用。
技术介绍
酵母分泌的蛋白酶以及对泡沫的负面影响已经引起国内外许多研究者的研究兴 趣，尤其在国内纯生啤酒超高速发展的情况下，残留在啤酒中的蛋白酶A(PrA)的活性问题 更引起人们重视。纯生啤酒由于其口味、营养等方面的优点已越来越受到消费者的青睐，啤酒泡沫 稳定性是衡量啤酒质量的重要指标，但是目前纯生啤酒在贮存过程中，存在泡沫稳定性下 降等问题，原因主要是由于纯生啤酒中残留的酵母蛋白酶A对啤酒泡沫蛋白的降解作用所 致。目前主要通过调整发酵工艺来改善啤酒泡沫性能，这些手段包括使用糖蛋白含量 高的小麦辅料；调整制麦、糖化、麦汁过滤与煮沸工艺；控制发酵温度与贮酒条件；适当添 加泡沫稳定剂或添加酵母PrA抑制剂。采取这些手段所要求的工艺条件较复杂，而添加剂 又存在安全隐患，不为消费者接受，因此都不能从根本上提高啤酒泡沫性能。β-葡聚糖的消极影响也是影响啤酒品质的重要因素，虽然制麦过程中麦芽会形 成专一性降解β-葡聚糖的内β-1，3-1，4-葡聚糖酶，但这种内源性β-葡聚糖酶热稳定 性差，其最适温度为40-45°C，55°C时即开始失活，在糖化温度(65°C)下5min酶活性仅存 1%。而且我国大麦与国外优质大麦相比，β-葡聚糖含量高且内源性β-葡聚糖酶水平低， β-葡聚糖的消极作用更明显。目前啤酒生产工业中主要通过培育低β-葡聚糖的大麦品种以及添加耐高温的 外源性葡聚糖酶来消除或降低葡聚糖的影响。但即使培育出低葡聚糖的大麦 品种作原料，在啤酒酿造时也仍然要添加外源性β “葡聚糖酶，因此并没有从根本上简化 啤酒生产的操作工艺。
技术实现思路
本专利技术提供了一种啤酒酵母工程菌，利用该菌株进行啤酒发酵解决了传统酵母发 酵制得的啤酒残留蛋白酶A对啤酒泡沫性能和高含量β _葡聚糖对啤酒过滤和稳定性带来 不利影响的问题。一种啤酒酵母工程菌，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，该酿酒 酵母染色体上的PEP4基因部分或全部被重组序列替换而破环，所述的重组序列包括β -葡 聚糖酶基因表达单元。所述的β -葡聚糖酶基因表达单元由依次连接的3-磷酸甘油酸激酶基因启动子 序列(PGKlp, Gebank登录号CAA42329)、信息素α -因子分泌信号序列(MFa ls, Gebank登 录号ΑΑΑ18405)、β -葡聚糖酶基因序列(bglS，SEQ ID NO. 3)和乙醇脱氢酶基因终止子序列(ADH1T，Gebank 登录号 CAY86205)组成。所述的重组序列包括来自质粒PUG6的卡拉霉素抗性基因序列(KanMX)。所述的选用来自酿酒酵母的PGKl强启动子具有增强表达外源酶基因的特性，所 选用的来自酿酒酵母的信息素α-因子分泌信号序列具有较好的引导外源酶基因在酵母 细胞的分泌和表达的能力，而所选用的来自酿酒酵母的乙醇脱氢酶基因终止子序列具有优 异的准确转录和翻译功能，上述的表达单元与酵母基因组的同源性可在一定程度上增加同 源重组整合的机率，有助于ΡΕΡ4基因的替换和β-葡聚糖酶基因的整合。而所采用的来自 质粒PUG6的卡拉霉素抗性基因不仅具有作为筛选同源重组子的筛选标记，而且在分子重 组酵母传代繁殖过程中具有自动丢失功能，以获得无抗性基因的分子重组酵母菌。所述的蛋白酶A被替换序列是从第686个碱基到第1987个碱基的序列。本专利技术将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)PRAD保藏在位于北京市朝阳 区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏日期为2009年04月14日，保藏号为CGMCC No. 3010。上述保藏菌株的主要生理生化特征细胞为椭圆形，短轴5 7微米，长轴7 9 微米，短长轴之比为1 1.2 1.3，细胞呈单个或成对排列，单个出芽为主，极少形成芽 簇；菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐。生长最适PH为5. 5。最适生长温 度 25-30 0C ο本专利技术提供了一种上述啤酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤在重组序列 两端连接同源臂序列，转化到感受态出发菌株中进行同源重组得到。连接重组序列上游的同源臂序列如SEQ NO. 1所示。连接重组序列下游的同源臂序列如SEQN0. 2所示。本专利技术又提供了上述啤酒酵母工程菌在制备纯生啤酒中的应用。本专利技术啤酒酵母工程菌通过将外源枯草芽孢杆菌β -葡聚糖酶基因表达单元通 过同源重组技术将工业酿酒酵母染色体上ΡΕΡ4基因的部分序列或全部序列替换，蛋白酶A 活性显著降低，而能稳定表达葡聚糖酶。由于同源重组效率和亲缘性差异较大的外源 基因在酿酒酵母中重组表达，因此给同源重组替换带来的是重组效率问题，而本专利技术设计 的来自酿酒酵母的信号肽序列、强启动子序列和终止子序列可以高效实现外源β-葡聚糖 酶基因序列在酿酒酵母中的重组表达。通过遗传稳定性和中试发酵试验证明，该构建的啤 酒酵母工程菌不仅遗传稳定性良好，而且具有优于出发菌株的啤酒酿造品质，如啤酒泡沫 稳定性提高，β “葡聚糖降解率提高，啤酒过滤速度改善，而且生理性能和生化特性并无明 显差异。附图说明图1为片断PGKlP、MFa Is在质粒pUC18中的克隆，形成质粒pUC18_PM示意图；图2为片断bglS、ADHlT在质粒pUC18中的克隆，形成质粒pUC18-BT示意图；图3为bglS基因表达单元PGKlp-MF a ls_bglS_ADHlT的形成示意图；图4为bglS基因表达单元与KanMX连接形成质粒pUC18_KPMBT示意图；图5为重组质粒YEPlac 181-KPMBT PCR的扩增鉴定凝胶电泳图谱；图6为重组质粒YEPlac 181-KPMBT的双酶切鉴定凝胶电泳图谱，泳道1为SmaI+EcoR I双酶切结果，泳道2为BamH I+EcoR I双酶切结果；图7为PCR扩增到的用来转化并替换PEP4的片断的凝胶电泳图谱(3732bp，1-8 为平行扩增)；图8为重组酿酒酵母菌PRAD的PCR鉴定凝胶电泳图谱(1. PEP4-Pl+KanMX-P2产 物；2. bglS-Pl+PEP4-P2 产物；3· PEP4-P1+PEP4-P2 产物)；图9为重组酿酒酵母菌PRAD的遗传稳定性PCR检测凝胶电泳图谱，泳道1_4模板 分别为重组酿酒酵母RPPD、WZ65以及第十代重组酿酒酵母PRAD。具体实施例方式1、出发菌株选用工业酿酒酵母WZ65(温州英博双鹿啤酒有限公司)作为出发菌株，经过刚果 红-β -葡聚糖选择性平板检验和液体发酵监测，证明该酿酒酵母不表达β “葡聚糖酶活， 同时该工业酵母经过染色体分离和孢子分离试验，证明其为二倍体。2、bglS同源重组表达质粒载体Y印Iac 181-KPMBT的构建及其酶切验证2. 1、同源重组各表达单元的克隆获得(l)bglS基因的获得及其验证 ! . 古胃 $ 包 ff 胃(B. Subtilis) ZJF-1A5 (Construction ofrecombinantindustrial Saccharomyces cerevisiae strain wit本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种啤酒酵母工程菌，出发菌株为酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），该酿酒酵母染色体上的ＰＥＰ４基因部分或全部被重组序列替换而破环，其特征在于：所述的重组序列包括β－葡聚糖酶基因表达单元。
【技术特征摘要】
一种啤酒酵母工程菌，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，该酿酒酵母染色体上的PEP4基因部分或全部被重组序列替换而破环，其特征在于所述的重组序列包括β 葡聚糖酶基因表达单元。2.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述的葡聚糖酶基因表 达单元由依次连接的3-磷酸甘油酸激酶基因启动子序列、信息素α-因子分泌信号序列、 β-葡聚糖酶基因序列和乙醇脱氢酶基因终止子序列组成。3.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述的重组序列包括卡拉霉 素抗性基因序列。4.根据权利要求1所述的啤酒酵母工程菌，其特征在于所述的ΡΕΡ4基因被替换的...
【专利技术属性】
技术研发人员：何国庆，陈启和，张强，阮晖，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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