一种蝎源抗病毒活性多肽及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种蝎源抗病毒多肽及用途，通过分子生物学和化学合成的方法，获得蝎源抗丙型肝炎病毒多肽ＡＶＰ－Ｗ３，然后实时定量ＰＣＲ方法测定了该蝎源活性多肽对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的抗病毒活性，在低浓度可以有效抑制ＨＣＶ病毒感染。蝎源活性多肽ＡＶＰ－Ｗ３在制备治疗或预防由ＨＣＶ病毒引起的疾病中的应用药物，有很好的前景。本发明专利技术的抗病毒多肽对ＨＣＶ活性高，方法简便，可作为抗ＨＣＶ病毒药物开发。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种蝎源具抗病毒功能的活性多肽。
技术介绍
丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)是1989年被鉴定出的一种非甲非乙型 肝炎的主要病原体，引起人类丙型肝炎，感染呈世界性分布。调查表明，全球HCV的感染率 约为3%，约1.7亿人感染HCV。我国HCV感染属中高流行区，平均感染率为3.2%。HCV感 染易慢性化，其慢性化率可高达85%，部分慢性丙型肝炎患者最终可发展为肝纤维化、肝硬 化甚至肝细胞癌。因此，HCV感染对人类的健康造成极大的危害。HCV属于黄病毒科(flaviviridae)，为有包膜的单正链小RNA病毒，由包膜、衣壳 和核心三部分组成。最外层包膜来源于宿主细胞膜，其中相嵌有病毒基因组编码的El及E2 蛋白，衣壳主要由核心蛋白(C蛋白)构成，核心为一单股正链RNA。其基因组长约9.6kb， 两侧为5’和3’非编码区，中间为开放读码框，编码一个含有3000多个氨基酸残基的多聚 蛋白，通过细胞与病毒的蛋白酶裂解为结构蛋白C、El和E2及非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、 NS4B、NS5A和NS5B。HCV基因组高度变异，尤其是HCV高变区(HVR)变异更大。HCV通过包膜上的El、E2与细胞受体结合并释放出正链RNA，并在病毒编码的 NS5BRdRp (RNA依赖的RNA聚合酶)的催化下进行RNA负链的合成，再通过负链复制出大量 的正链，与多蛋白体裂解产生的病毒蛋白包装为成熟病毒颗粒。在整个HCV病毒的复制周 期中，有几个关键的环节可作为抗病毒药物的作用靶点病毒多蛋白体的加工(NS3-NS4A 丝氨酸蛋白酶)，病毒基因的转录与复制(NS5B RdRp聚合酶、NS3解旋酶)，病毒基因的复 制表达的调控(IRES等调控元件)，病毒对细胞的穿入(E1、E2蛋白)等。破坏或抑制其中 的任何一个环节都可有效控制HCV病毒的复制。针对HCV病毒复制的各个环节研发抗HCV药物正如火如荼，如NS2-NS3蛋白酶抑 制剂，NS3-NS4A丝氨酸蛋白酶的抑制剂，NS5B RdRp聚合酶抑制剂，NS3解旋酶/核苷三磷 酸酶抑制剂，IRES反义核酸等。然而，目前临床上有效的仅为非特异性药物干扰素和利巴 韦林联合治疗丙型肝炎，但并非对所有慢性丙型肝炎患者均有效。加上HCV自身遗传物质 不稳定，容易发生突变，从而使得疫苗对这种新的突变病毒的预防作用降低或者完全失效。 并且目前在临床上还没有有效的HCV疫苗。因此，研发新型、低毒、特异的抗HCV病毒药物 势在必行。阳离子防御肽是一类由宿主生成，并且在天然免疫中特异性发挥防御性作用的一 类小肽。这一类小分子多肽通常由10-50个氨基酸构成，静电荷从+2到+9不等，在生物体 抵御微生物的入侵中发挥重要的作用。根据结构的差别，阳离子防御肽可以分为如下几类 含有2-4个β片层的两亲性分子、两亲性α螺旋、卷曲结构、以及含有高级结构的分子。阳 离子防御肽在体内对细菌、真菌、寄生虫、以及病毒的侵染均有有效的抵御作用。研究表明， 蜂毒溶血肽Melitiin和天蚕素Cecropins在亚毒性浓度下通过阻遏基因表达来抑制HIV-I 病毒的增殖，爪蟾抗菌肽Magainin-2对疱疹病毒HSV-I和HSV-2有一定的抑制效果，这些多肽都是α螺旋类阳离子防御肽。目前的研究表明，α螺旋类阳离子防御肽特异性作用 于有包膜的RNA病毒及DNA病毒，其作用方式通常是作用于病毒进入的过程，或者是直接作 用于病毒的包膜。例如，Dermas印tin就是通过作用于HIV的包膜而引起HIV的失活，从而 达到抗病毒的作用。所以，阳离子防御肽不再是传统的疫苗防治，而是通过直接抑制病毒达 到抗病毒的目的。蝎子中阳离子防御肽的研究也已经有多年的历史。其中除了从淋巴系统中发现的 防御肽外，更多的是从蝎毒腺中分离到的防御肽，例如Hadrurin，Scorpine，Opistoporin, Parabutoporin, ISCT, Pandinin0这些肽的功能都已经得到有效的鉴定。本专利技术人所在实 验室长期从事蝎毒素的研究，目前从文库中筛选并鉴别了系列阳离子多肽。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种抗丙型肝炎病毒活性高的阳离子多肽。为了实现上述目的，首先构建高质量东亚钳蝎毒腺组织cDNA文库，具体包括蝎毒 腺总RNA的分离和mRNA纯化，cDNA的第一链和第二链合成，双链cDNA与pSPORTl载体的 连接和转化，获得蝎毒腺组织cDNA文库。在构建文库的基础上，随机挑选50克隆子进行测 序，序列分析发现W3克隆子为一个新的东亚钳蝎抗菌肽基因，命名为avp-W3。本专利技术公开了一种分离的多肽基因avp-W3，其序列为SEQ ID NO :1所示的核苷酸 j^-^lj :gacctctcccaacagaaacaccagaaatatttttgccactagtccaccaaactgtcgagaatgaagactcag tttgccatcttcctcatcaccctagttctgtttcaaatgttctcccagtcggatgctatcttcaaggctatctggag tggaattaagagcctgttcggaaagagaggattgagcgacctagatgacctcgatgagtcgttcgatggagaagtct cacaggccgatattgacttcctgaaagaactaatgcaatagtttcaacgtaattacgatggacgtttaacattgctc ctttctagatttcgcgaaatgctaccgagttatttcatacattaaacgataaataaaatacttttctgccaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaaaaa0avp-w3的前体组织形式编码68个氨基酸残基，由三个部分组成，即信 号肽(23个残基)、成熟肽(13个残基)和前体肽(32个残基)。基于蝎毒素前体C末端残 基的加工规则，avp-w3末端最后的残基Phe被特异性羧肽酶(Carboxy-p印tidase)切除， 且被酰氨化，如图1所示，cDNA序列下方为推断的对应氨基序列；信号肽氨基酸以单下划线 标记；成熟肽氨基酸以黑体标记；方框部分氨基酸为羧肽酶识别位点；阴影部分氨基酸为C 端前体肽。因此，本专利技术提供一个蝎源抗病毒活性多肽AVP-W3，其序列为SEQ ID NO :2所 示IFKAIWSGIKSLF。本专利技术公开了一种高效抗丙型肝炎病毒的AVP-W3多肽，其序列为SEQ ID NO :2所 示的氨基酸序列。通过固相化学合成的办法，得到了纯度达95%以上的合成多肽AVP-W3。 抗病毒结果表明合成多肽AVP-W3对HCV增殖的高效抑制作用，在20 μ g/mL时，AVP-W3对 HCV的抑制率就可以达到100%抑制。本专利技术同时公开了蝎源抗病毒活性多肽AVP-W3在制备预防或治疗HCV感染的药 物中的应用。本专利技术的蝎源抗病毒活性多肽具有抑制病毒感染的功能，抑制效果好，无副作 用，其在预防和治疗由HCV所引起的感染效果显著。本专利技术还公开了预防或治疗HCV感染的药物，其中含有AVP-W3多肽。本专利技术涉及的AVP-W3抗菌多肽，只含有13个氨基酸，生产成本低，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种东亚钳蝎抗病毒多肽，其氨基酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示。

【技术特征摘要】
一种东亚钳蝎抗病毒多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。2.编码权利要求1所述多肽的基因，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。3.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文鑫，郑从义，曹志贱，吴英亮，赵震环，鄢然，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]