【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于一种多肽药物的纯化，特别涉及一种替尔泊肽的纯化方法。
技术介绍
1、替尔泊肽(tirzepatide)是礼来公司开发的一款葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)受体和胰高血糖素样肽-1(glp-1)受体的双重激动剂，其cas号为2023788-19-2。替尔泊肽是一种具有c20脂肪二酸部分的39个氨基酸修饰肽，能够结合白蛋白并延长半衰期。2023年7月27日，礼来公布了两项关于替尔泊肽的临床3期试验结果，结果显示，平均减重效果高达26.6％。替尔泊肽通过激活glp-1受体，能够减少饥饿感，从而减少饮食和热量的摄入，而激活gip受体可以减少饮食和热量的摄入并增加能量消耗。
2、由于替尔泊肽固相合成中的肽链过长，侧链含有较长的修饰，形成空间位阻较大，从而导致较多的缺失肽杂质，如缺失肽ser11和缺失肽ile12等以及缺失gly4以及增加gly30等常见又难以去除的杂质。
3、cn112661815a专利技术公开了一种tirzepatide的纯化方法，该纯化方法将tirzepatide粗肽溶于纯化水中，用氨水调ph8.0至完全溶解，获得粗肽溶液后，通过二步纯化获得tirzepatide。该专利技术方法的收率为70％左右，获得的tirzepatide纯度99.0％以上，单杂0.15％以下。但是，该专利技术对于特定的缺失肽ser11和缺失肽ile12等单杂无法完全控制至0.1％以下，去除效果较差。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的至少一个
2、本专利技术所采取的技术方案是：
3、本专利技术提供一种替尔泊肽的纯化方法，包括以下步骤：
4、1)用碳酸盐缓冲盐溶解替尔泊肽原料，过滤收集滤液备用；
5、2)对步骤1)得到的滤液进行第一步纯化，以反相填料为固定相，乙酸溶液为a相，极性有机溶剂为b相，进行梯度洗脱，收集纯度大于93％，单杂小于1％的组分；
6、3)对步骤2)得到的组分进行第二步纯化，以反相填料为固定相，乙酸缓冲盐为a相，极性有机溶剂为b相，进行梯度洗脱，收集纯度大于99％，单杂小于0.3％的组分；
7、4)对步骤3)得到的组分进行第三步纯化，以反相填料为固定相，碳酸缓冲盐为a相，极性有机溶剂为b相，进行梯度洗脱，收集纯度大于99.5％，单杂小于0.1％的组分；
8、5)对步骤4)得到的组分进行浓缩、调节ph、过滤除菌、干燥，得到替尔泊肽。
9、在一些实例中，所述步骤1)和步骤4)中的碳酸缓冲盐选自碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾或碳酸铵溶液。
10、在一些实例中，所述碳酸缓冲盐浓度为10～100mmol。
11、在一些实例中，所述步骤2)中的乙酸溶液的浓度的体积百分比为0.05％～3％。
12、在一些实例中，所述步骤3)中的乙酸缓冲盐选自乙酸铵、乙酸钠或乙酸钾溶液，所述乙酸缓冲盐的浓度为10～500mmol，ph7.5～8.5。
13、在一些实例中，以体积百分比计算，所述步骤2)的梯度洗脱的方法为：a％：65％～55％，b％：35％～45％，线性梯度洗脱80～90min。
14、在一些实例中，以体积百分比计算，所述步骤3)的梯度洗脱的方法为：a％：70％～60％，b％：30％～40％，线性梯度洗脱80～90min。
15、在一些实例中，以体积百分比计算，所述步骤4)的梯度洗脱的方法为：a％：73％～60％，b％：27％～40％，线性梯度洗脱60～70min。
16、在一些实例中，所述极性有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈或异丙醇中的至少一种。
17、在一些实例中，所述反相填料选自四烷基硅烷键合硅胶填料、八烷基硅烷键合硅胶填料或十八烷基硅烷键合硅胶填料。
18、本专利技术的有益效果是：
19、替尔泊肽固相合成后含有大量的三氟乙酸，常用氨水或乙腈增加其溶解度，但其ph值比较难控制以及溶液的缓冲能力较弱，本专利技术用碳酸盐缓冲体系溶解粗肽，溶解体积小，粗肽浓度高，可以达到20-50g/l，提高分离效果。
20、本专利技术的方法中第一次纯化为酸性条件，第二次纯化为碱性条件，其方法的适用性较强，运用较广，对极性相近的杂质去除效果比较好。即使在现有固相合成的粗肽纯度较差的条件下，该方法仍能达到纯度99.5％以上，单杂控制0.1％以下，总纯化收率高达70％以上。
21、本专利技术的一些实施例中，第一步纯化采用八烷基硅烷键合硅胶填料，稀乙酸作为缓冲体系a相，100％乙腈为b相，进行梯度洗脱，可以去除替尔泊肽很多杂质，特别是极性与主峰很相近的缺失肽杂质，如缺失肽ser11和缺失肽ile12以及缺失肽ser11-ile12，该缺失肽在现有的替尔泊肽合成工艺中，特别容易产生，为替尔泊肽的常见杂质。
22、本专利技术的一些实施例中，第二步纯化采用八烷基硅烷键合硅胶填料，乙酸钠作为缓冲体系a相，100％乙腈为b相，进行梯度洗脱，对于缺失肽gly4和缺失肽gly30以及加gly4或gly30等杂质具有较好的除杂效果。
23、本专利技术的一些实施例中，第三步纯化采用八烷基硅烷键合硅胶填料，碳酸氢铵作为缓冲体系a相，100％乙腈为b相，进行梯度洗脱，一方面可以进一步提高纯度，控制单杂在0.1％以下的同时，另一方面还可以将前面的乙酸钠盐除，碳酸氢铵在后续的旋蒸与冻干中得以挥发，转化为无盐形式，方便后续根据需求转化为所需的盐形式。
24、替尔泊肽在本专利技术的一些实施例中，采用了标定其含量后，加入氢氧化钠形成钠盐形式，可以增加其溶解度，方便后续剂型的开发与改进，优于乙酸盐形式。
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1.一种替尔泊肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤4)中的碳酸缓冲盐选自碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾或碳酸铵溶液。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述碳酸缓冲盐浓度为10～100mMol。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中的乙酸溶液的浓度的体积百分比为0.05％～3％。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中的乙酸缓冲盐选自乙酸铵、乙酸钠或乙酸钾溶液，所述乙酸缓冲盐的浓度为10～500mMol，pH7.5～8.5。
6.根据权利要求1或4所述的纯化方法，其特征在于，以体积百分比计算，所述步骤2)的梯度洗脱的方法为：A％：65％～55％，B％：35％～45％，线性梯度洗脱80～90min。
7.根据权利要求1或5所述的纯化方法，其特征在于，以体积百分比计算，所述步骤3)的梯度洗脱的方法为：A％：70％～60％，B％：30％～40％，线性梯度洗脱80～90min。
<...【技术特征摘要】
1.一种替尔泊肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤4)中的碳酸缓冲盐选自碳酸氢铵、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾或碳酸铵溶液。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述碳酸缓冲盐浓度为10～100mmol。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中的乙酸溶液的浓度的体积百分比为0.05％～3％。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中的乙酸缓冲盐选自乙酸铵、乙酸钠或乙酸钾溶液，所述乙酸缓冲盐的浓度为10～500mmol，ph7.5～8.5。
6.根据权利要求1或4所述的纯化方法，其特征在于，以体积百分比计算，所述步骤2)的梯度洗脱的方法为...
【专利技术属性】
技术研发人员：李想，罗英蓬，陈德稳，罗香，覃宇桢，
申请(专利权)人：广东省卓肽医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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