【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物，具体地说，是使用微流控芯片检测埃博拉病毒和麻疹病毒表达的特异性探针和检测技术及其应用。
技术介绍
1、埃博拉病毒、麻疹病毒均为重大烈性传染病病毒，都能导致高致死率和高传染性的疾病。在人类历史上，传染病严重威胁人类健康和生命，世界经济发展的同时给病毒传播带来了新的更快的传播机会，随着全球化时代发展，国际贸易和国际旅游的增加，许多传染病在国际间传播流行的危险性急剧增加，极大威胁着公众健康，全球不断面临着公共卫生安全威胁。
2、埃博拉病毒(ebola virus，ebov)是一种十分罕见的病毒，可引发急性传染病埃博拉出血热，感染者症状有恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、体外出血、发烧等。ebov潜伏期为2-21天，平均潜伏期为5-10天，可通过与患者体液直接接触，或与患者皮肤、黏膜等接触而传染，是现存的毒性最大的病毒，致死率高达50％-90％。ebov为丝状病毒科，共有5个亚型，包括扎伊尔型、苏丹型、科特迪特、本迪布焦型和莱斯顿型，其中毒力性最强的是扎伊尔型。ebov基因组为单链、负链rna，编码7个蛋白，分别为包膜糖蛋白、衣壳蛋白、基质蛋白vp24、vp40，非结构蛋白vp30、vp35，以及聚合酶l。埃博拉出血热目前尚无有效的治疗手段，因为特别危险，埃博拉病毒的生物安全等级被定为4级。迄今为止ebov已经造成了多次疫情大暴发，其极高的传染性和致死率使埃博拉疫情已经成为非洲地区最大的问题，尤其在人口频繁流动的今天，埃博拉出血热已经成为国际关注的突发公共卫生事件，被认为是世界上最凶猛的
3、麻疹(measles virus，mv)是一种传染性和致病性很强的疾病，麻疹疫苗问世后其发病率已大大降低，但在世界范围内仍时有疫情暴发。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性呼吸道疾病，是一种自限性疾病，具有高度传染性。麻疹的典型症状是高热、咳嗽、流鼻涕、流眼泪、口腔麻疹黏膜斑，首发症状出现3-5日后出现全身斑丘疹，出疹期间发热更高。病后大多可终身免疫，常见的并发症有肺炎、心肌炎、喉炎等。麻疹主要通过飞沫传播，直接接触感染者的呼吸道分泌物也可传播，被感染者出疹前后5天均具有传染性。麻疹病毒是麻疹的病原体，是已知的最具传染性病原体之一，人类是麻疹病毒的唯一宿主，以6个月至5岁小儿发病率最高。麻疹病毒基因组为不分节段的单股负链rna，主要有6个结构基因，分别编码核蛋白、基质蛋白、血凝素蛋白、融合蛋白、磷蛋白和多聚酶，其中血凝素蛋白和核蛋白基因变异最大。近年因长期疫苗免疫的结果，麻疹流行强度减弱，平均发病年龄后移。由于麻疹病毒的感染速度非常快，所以初期给予疑似麻疹患者实施有效的诊断至关重要，并且一旦确诊就必须要立即选用相应的防治措施进行预防，从而有效降低麻疹暴发率。目前尚无特效治疗药物，风疹、寨卡病毒病、eb病毒感染等在症状上与麻疹相似，及时准确的检测对于麻疹的治疗、病情的监测及疫情的控制至关重要。
4、目前，用于检测埃博拉病毒的主要技术有核酸检测技术和抗原检测。核酸检测技术中的实时聚合酶链反应(rt-pcr)技术、重组聚合酶扩增技术、环介导等温扩增技术等等。这些技术敏感度和特异度均较高，但是有的对引物和探针的特异性要求较高，有的引物、荧光探针设计困难，且稳定性不佳。环介导等温扩增技术中使用多套引物增大了非特异结合，尤其多种同科病毒的干扰会导致引物的浪费，降低该技术敏感度，进而出现漏检；基因芯片技术最大优点为高通量、大量样品快速检测，存在成本高、多种探针最佳条件的不一致、对杂交条件选择要求较高等问题。胶体金法主要是基于病毒抗原和igm、igg抗体的免疫检测方法。胶体金法使用简单，不需要仪器，不受实验条件的限制，即开即用，但其致命缺点是敏感性较差，非常容易漏筛。
5、由于麻疹疫苗的广泛采用，近些年来不典型麻疹和轻型麻疹病例较多，给诊断带来一定困难，也在一定程度上影响了治疗和防疫工作的及时性。麻疹的检测方法有病毒分离培养、elisa、化学免疫发光法、pcr等，但病毒分离培养耗时费力，后几种方法对操作人员的要求较高，且需要专门的仪器设备，不利于现场快速检测。
6、微流控芯片(microfluidic chip)是当前微全分析系统发展的热点领域，具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点，可直接将dna引物探针固定于芯片表面，样本通过与芯片上已知碱基序列的dna片段互补杂交，从而得到样品的遗传信息，确定样品的核酸序列，并可分析基因表达量。微流控芯片平行面的液体通道互相不影响，大大缩短检测时间，提升检测效率。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于微流控芯片技术的埃博拉病毒和麻疹病毒检测方法，具有快速、准确、高灵敏度的特点，可为埃博拉病毒和麻疹病毒的快速检测和传染病防控提供一种新的技术手段。
2、本专利技术针对埃博拉病毒和麻疹病毒检测的实际需求，研发了微流控芯片，该方法敏感性强，特异度高，所用试剂耗材均可常温保存，便于运输携带，尤其适合病原体现场的快速检测。
3、本专利技术的第一方面，提供一种基于微流控芯片技术的埃博拉病毒和麻疹病毒检测方法，包括以下步骤：
4、(a)制备特异性引物和探针
5、通过对埃博拉病毒和麻疹病毒序列比对，选择特异、保守片段作为检测靶基因区域设计引物；在上述上下游引物的范围内，序列相对特异区设计一条病毒特异性寡核苷酸探针，探针5’使用fam标记，3’使用tamra标记；如表1所示：
6、表1病原体检测引物和探针序列
7、
8、(b)微流控芯片制备
9、采用8孔芯片，设立2个阴性对照孔，样本检测6孔；共检测2种病原体，每种3孔(分为阳性对照1孔，样本检测2孔)；将检测孔的检测试剂(表2)预混浓缩至2ul分装到对应的样本检测孔和阴性对照孔中；阳性对照孔的检测试剂(表3)预混浓缩至2ul分装到对应的阳性对照孔中。按照下列步骤进行干燥：0.15mpa，-55℃持续4h，后每隔1h升高10℃，最后到15℃时恢复常温常压；在260℃，5s条件下快速进行热键合(场所保持干燥)封膜，将边缘多余封膜进行裁剪，完成芯片制备。
10、(c)检测方法
11、本专利技术微流控芯片中的引物、探针的浓度和酶的用量进行了优化，并同时优化了反应条件。本专利技术采用微流控芯片技术，将检测所需试剂(表2和表3)预封装至对应孔中，使用时将提取好的病原体核酸注入芯片，放入微流控芯片检测仪中进行反应即可，反应条件见表4。
12、表2样本检测孔和阴性对照孔芯片预封装试剂表
13、
14、表3阳性对照孔芯片预封装试剂表
15、
16、表4芯片检测反应条件
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【技术保护点】
1.一种基于微流控技术的埃博拉病毒和麻疹病毒检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于微流控技术的埃博拉病毒和麻疹病毒检测方法，其特征在于，所述的样本检测孔和阴性对照孔中预封装的检测试剂如表2所示，所述的阳性对照孔中预封装的检测试剂如表3所示：
3.根据权利要求1所述的基于微流控技术的埃博拉病毒和麻疹病毒检测方法，其特征在于，步骤(C)中所述的反应条件如表4所示：
【技术特征摘要】
1.一种基于微流控技术的埃博拉病毒和麻疹病毒检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于微流控技术的埃博拉病毒和麻疹病毒检测方法，其特征在于，所述的样本检测孔和阴性对...
【专利技术属性】
技术研发人员：殷建华，曹广文，蒲蕊，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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