【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种小白链霉菌基因工程菌及其在血清素和n-乙酰血清素生产中的应用。
技术介绍
1、由色氨酸合成褪黑素（melatonin）的生物合成途径的中间代谢产物有血清素（serotonin）和n-乙酰血清素（n-acetylserotonin）。其中，血清素（serotonin），又名5-羟基色胺，最早从血清中发现，广泛存在于哺乳动物组织中，特别是在脑组织中的浓度较高，是调节神经活动的一种重要物质。血清素具有收缩血管、调节情绪、防止脑老化等作用，是一类抗抑郁药。而n-乙酰血清素（n-acetylserotonin）是自然界存在的一种小分子化合物，是从血清素到褪黑素的内源性合成反应的中间体。和褪黑素相同，n-乙酰血清素也是褪黑素受体mt1、mt2和mt3的激动剂，被认为是一种神经递质，对研究mt的受体亲和力和拮抗性作用有直接意义。n-乙酰血清素还具有抗氧化、抗炎和神经保护作用，已被用于治疗神经元细胞，是一种新型临床药物。
2、目前，血清素的生产工艺主要为化学合成，合成工艺流程长，使用的原料种类较多，且存在反应条件苛刻和废弃物多等缺点。n-乙酰基血清素的生产方法主要为化学法，以血清素为反应起始物，采用醋酸酐作为乙酰化试剂，经两步反应合成，会同时生成杂质n,o-双乙酰基血清素，造成后处理复杂，收率低，产品品质较差。生物法合成血清素和n-乙酰血清素对环境友好，应用前景广阔。
3、中国专利技术专利申请cn202111391114.x公开了一种以5-羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌株、构建及
4、现有血清素和n-乙酰基血清素的化学生产方法使用大量有机试剂，对环境不友好。现有血清素和n-乙酰血清素的生物合成技术均利用条件致病菌大肠杆菌进行生产，存在安全隐患；均利用质粒系统异源表达相关基因，稳定性难以保障；在生物转化时需要添加诱导剂和抗生素，造成生产成本增加，且最终n-乙酰血清素的产量较低。
5、本专利技术目的在于提供一种小白链霉菌基因工程菌及其在血清素和n-乙酰血清素生产中的应用。
6、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
7、一种小白链霉菌基因工程菌，以小白链霉菌为出发菌株整合内源的n-乙酰基转移酶（snat）基因、内源的色氨酸脱羧酶（tdc）基因、异源的色氨酸转运蛋白（mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（luz15）基因中的一种或几种基因。
8、所述出发菌株为小白链霉菌（streptomyces albulus） cicc 11022；n-乙酰基转移酶（snat）基因和色氨酸脱羧酶（tdc）基因源于出发菌株；异源的色氨酸转运蛋白（mtr）基因来自escherichia coli mg1655；色氨酸羟化酶（luz15）基因来自actinomaduraluzonensis dsm43766。
9、所述小白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶（tdc）基因；
10、所述小白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶（tdc）基因和n-乙酰基转移酶（snat）基因；
11、所述小白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶（tdc）基因、异源的色氨酸转运蛋白（mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（luz15）基因；
12、或，所述白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶（tdc）基因和n-乙酰基转移酶（snat）基因、异源的色氨酸转运蛋白（mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（luz15）基因。
13、一种所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，利用pcr技术、酶切方法对含有组成型强启动子sp43和核糖体结合位点序列sr40的载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；利用无缝克隆方法将所述含有内源的n-乙酰基转移酶（snat）基因、内源的色氨酸脱羧酶（tdc）基因、异源的色氨酸转运蛋白（mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（luz15）基因中的一种或几种基因片段与上述线性化载体片段进行连接、转化，得到重组表达载体；将所述重组表达载体先转入大肠杆菌et12567/puz8002，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌cicc 11022染色体上，即获得工程菌株。
14、所述工程菌株为使用 ecor i和 ndei酶切含有组成型强启动子sp43和核糖体结合位点序列sr40的载体pset152-sp43-sr40-pls，获得线性化载体片段，通过infusion无缝克隆技术与内源的色氨酸脱羧酶（tdc）基因进行连接，获得重组表达质粒pset152-tdc；将所得重组表达质粒pset152-tdc转移到大肠杆菌et12567/puz8002中，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌cicc 11022，使pset152-tdc整合到该菌株的染色体上，获得tdc表达工程菌株（小白链霉菌q-tdc）。
15、所述工程菌株为使用 ecor i酶切载体pset152-tdc获得线性化片段，通过infusion无缝克隆技术与内源的n-乙酰基转移酶（snat）基因进行连接，获得重组表达质粒pset152-tdc-snat；将表达质粒pset152-tdc-snat转移到大肠杆菌et12567/puz8002中，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌cicc 11022，使pset152-tdc-snat整合到该菌株的染色体上，获得tdc和snat共表达工程菌株（小白链霉菌q-tdc-snat）。
16、所述工程菌株为将异源的色氨酸转运蛋白（mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（luz15）基因连接至线性化质粒p3sv-ths上，得到重组表达质粒p3sv-ths-mtr-luz15，利用接合转移将p3sv-ths-mtr-luz15转入所述小白链霉菌q-tdc，使p3sv-ths-mtr-luz15整合到该菌株的染色体上，得到tdc、mtr和luz15共同高表达的基因工程菌（小白链霉菌q-tdc-mtr-luz15）。
17、所述工程菌株为利用接合转移将p3sv-ths-mtr-luz15转入上述小白链霉菌q-tdc-snat，使p3sv-ths-mtr-luz15整合到该菌株的染色体上，得到tdc、snat、mtr和luz15共同高表达的基因工程菌（小白链霉菌q-tdc-snat-mtr-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种小白链霉菌基因工程菌，其特征在于：以小白链霉菌为出发菌株整合内源的N-乙酰基转移酶SNAT基因、内源的色氨酸脱羧酶TDC基因、异源的色氨酸转运蛋白Mtr基因和异源的色氨酸羟化酶Luz15基因中的一种或几种基因。
2.根据权利要求1所述的小白链霉菌基因工程菌，其特征在于：所述出发菌株为小白链霉菌Streptomyces albulus CICC 11022；N-乙酰基转移酶SNAT基因和色氨酸脱羧酶TDC基因源于出发菌株；异源的色氨酸转运蛋白Mtr基因来自Escherichia coli MG1655；色氨酸羟化酶Luz15基因来自Actinomadura luzonensis DSM43766。
3.根据权利要求1或2所述的小白链霉菌基因工程菌，其特征在于：所述小白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶TDC基因；
4.一种权利要求1所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：利用PCR技术、酶切方法对含有组成型强启动子Sp43和核糖体结合位点序列SR40的载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；利用无
5.根据权利要求4所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述工程菌株为使用EcoR I和Nde I酶切含有组成型强启动子Sp43和核糖体结合位点序列SR40的载体pSET152-Sp43-SR40-pls，获得线性化片段，通过Infusion无缝克隆技术与内源的色氨酸脱羧酶TDC基因进行连接，获得重组表达质粒pSET152-TDC；将所得重组表达质粒pSET152-TDC转移到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌CICC 11022，使pSET152-TDC整合到该菌株的染色体上，获得TDC表达工程菌株—小白链霉菌Q-TDC。
6.根据权利要求4所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述工程菌株为使用EcoR I酶切载体pSET152-TDC获得线性化片段，通过Infusion无缝克隆技术与内源的N-乙酰基转移酶SNAT基因进行连接，获得重组表达质粒pSET152-TDC-SNAT；将表达质粒pSET152-TDC-SNAT先转移到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌CICC 11022，使pSET152-TDC-SNAT整合到该菌株的染色体上，获得TDC和SNAT共表达工程菌株—小白链霉菌Q-TDC-SNAT。
7.根据权利要求4或6所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述工程菌株为将异源的色氨酸转运蛋白Mtr基因和异源的色氨酸羟化酶Luz15基因连接至线性化质粒p3SV-ths上，得到重组表达质粒p3SV-ths-Mtr-Luz15，利用接合转移将p3SV-ths-Mtr-Luz15转入所述小白链霉菌Q-TDC，使p3SV-ths-Mtr-Luz15整合到该菌株的染色体上，得到TDC、Mtr和Luz15共同高表达的基因工程菌小白链霉菌Q-TDC-Mtr-Luz15。
8.根据权利要求7所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述工程菌株为利用接合转移将p3SV-ths-Mtr-Luz15转入上述小白链霉菌Q-TDC-SNAT，使p3SV-ths-Mtr-Luz15整合到该菌株的染色体上，得到TDC、SNAT、Mtr和Luz15共同高表达的基因工程菌—小白链霉菌Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15。
9.一种权利要求1所述的小白链霉菌基因工程菌的应用，其特征在于：所述工程菌在血清素或N-乙酰血清素生产中的应用。
10.根据权利要求9所述的小白链霉菌基因工程菌的应用，其特征在于：所述工程菌在以5-羟基色氨酸或色氨酸为底物生产血清素中的应用；或，所述工程菌在以5-羟基色氨酸、色氨酸或血清素为底物生产N-乙酰血清素中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种小白链霉菌基因工程菌，其特征在于：以小白链霉菌为出发菌株整合内源的n-乙酰基转移酶snat基因、内源的色氨酸脱羧酶tdc基因、异源的色氨酸转运蛋白mtr基因和异源的色氨酸羟化酶luz15基因中的一种或几种基因。
2.根据权利要求1所述的小白链霉菌基因工程菌，其特征在于：所述出发菌株为小白链霉菌streptomyces albulus cicc 11022；n-乙酰基转移酶snat基因和色氨酸脱羧酶tdc基因源于出发菌株；异源的色氨酸转运蛋白mtr基因来自escherichia coli mg1655；色氨酸羟化酶luz15基因来自actinomadura luzonensis dsm43766。
3.根据权利要求1或2所述的小白链霉菌基因工程菌，其特征在于：所述小白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶tdc基因；
4.一种权利要求1所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：利用pcr技术、酶切方法对含有组成型强启动子sp43和核糖体结合位点序列sr40的载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；利用无缝克隆方法将所述含有内源的n-乙酰基转移酶snat基因、内源的色氨酸脱羧酶tdc基因、异源的色氨酸转运蛋白mtr基因和异源的色氨酸羟化酶luz15基因中的一种或几种基因片段与上述线性化载体片段进行连接、转化，得到重组表达载体；将所述重组表达载体先转入大肠杆菌et12567/puz8002，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌cicc 11022染色体上，即获得工程菌株。
5.根据权利要求4所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述工程菌株为使用ecor i和nde i酶切含有组成型强启动子sp43和核糖体结合位点序列sr40的载体pset152-sp43-sr40-pls，获得线性化片段，通过infusion无缝克隆技术与内源的色氨酸脱羧酶tdc基因进行连接，获得重组表达质粒pset152-tdc；将所得重组表达质粒pset152-tdc转移到大肠杆菌et12567/puz8002中，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌cicc 11...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦加阳，张敏，扶成豪，王秀文，姚庆收，孔令慧，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：
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