【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及苯丙素类化合物的生产领域，并且具体涉及用于生产苯丙素类化合物(例如香豆酸或覆盆子酮)的遗传修饰菌株。
技术介绍
0、现有技术
1、多年来，“天然”调味剂和香料的生物生产一直是工业研究的一个重要领域，以满足日益追求环保的消费者的需求。合成生物学，特别是利用微生物，使这种自然生产成为可能，但产量并不总是足以进行大规模生产。
2、覆盆子(rubus idaeus)的风味与200多种化合物相关，但覆盆子酮(frambinone)(一种天然酚类化合物)是影响最大的化合物，其定义了覆盆子特有的风味(klesk等人，2004年，《农业与食品化学杂志》52，5155-61；larsen等人，1991年，《斯堪的纳维亚农业学报》41，447-54(klesk et al.,2004,j.agric.food chem.52,5155-61；larsen et al.,1991,acta agric.scand.41,447-54))。
3、由于其仅少量存在于覆盆子中(1mg-4mg/kg果实)，因此天然覆盆子酮极其珍贵(larsen等人，1991年)。然而，由于其天然可得性有限，利用生物技术进行生产是非常期望的。
4、在这种情况下，通过插入编码苯丙素类化合物(特别是覆盆子酮)的生物合成途径中一些关键酶的异源基因，可以在微生物中重建该途径。
5、酪氨酸是苯丙素类化合物生物合成的重要氨基酸，因为其特别是香豆酸或覆盆子酮的前体。
6、事实上，覆盆子酮可以芳香族氨基酸l
7、在第一步中，酪氨酸通过酪氨酸氨裂解酶(tal，ec 4.3.1.23)脱氨基，形成香豆酸。在4-香豆酸:辅酶a连接酶(4cl，ec 6.2.1.12)的催化下，辅酶a(coa)分子被接枝到香豆酸上。然后香豆酰辅酶a被亚苄基丙酮合酶(bas，ec 2.3.1.212)转化成4-羟基亚苄基丙酮。该反应是一种脱羧缩合反应，并使用丙二酰辅酶a单元作为共底物。最后一步是通过亚苄基丙酮还原酶将4-羟基亚苄基丙酮还原成覆盆子酮。
8、因此，开发过量生产酪氨酸的菌株作为生产苯丙素类化合物(特别是覆盆子酮)的平台是这些化合物生物合成的关键起点。
9、然而，微生物中酪氨酸的生产既复杂又受到严密调控。这是因为酪氨酸生产途径(也称为莽草酸途径(shikimate pathway))中的一些酶在负反馈回路中受这种氨基酸调节，当细胞中的浓度过高时，这种氨基酸会通过与抑制位点结合来抑制这些酶的活性。当微生物中存在过多量的酪氨酸时，这种调节系统被称为反馈抑制。
10、尽管如此，应该可以通过诱变获得对这种抑制具有“抗性”的酶，从而解除对酪氨酸生产途径的调控。这些对酪氨酸反馈抑制具有抗性的突变体被称为fbr突变体，意为“反馈抗性”。
11、许多文章描述了大肠杆菌中这一途径的失调，并且对一种酶进行了特别深入的研究：dahp合酶(dahp＝3-脱氧-d-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸)。莽草酸途径中的第一反应是磷酸(烯醇)丙酮酸(pep)和赤藓糖-4-磷酸(e4p)缩合生成dahp。
12、这种dahp合酶活性由大肠杆菌(e.coli)中的3种同工酶进行：arog(苯丙氨酸反馈抑制)、arof(酪氨酸反馈抑制)和aroh(色氨酸反馈抑制)。这些蛋白质的结构是已知的，与反馈抑制相关的亚结构(以及所涉及的氨基酸)在文献中也有详尽的描述。
13、kikuchi等人，1997年和cui等人，2019年，在大肠杆菌中鉴定、描述和研究了分别对苯丙氨酸和酪氨酸反馈抑制具有抗性的突变体arogfbr和aroffbr。lütke-eversloh和stephanopoulos也在大肠杆菌(e.coli)中描述了tyra蛋白的fbr突变体(突变体tyrafbr)(2005年)(lütke-eversloh和stephanopoulos，《应用及环境微生物学》2005年11月；71(11)：7224-8(lütke-eversloh and stephanopoulos,appl.environ microbiol.2005nov；71(11):7224-8))。
14、2007年，lütke-eversloh和stephanopoulos(lütke-eversloh和stephanopoulos，《应用及环境微生物学》2007年11月；75(1)：103-10(lütke-eversloh andstephanopoulos,appl.environ microbiol.2007nov；75(1):103-10))还描述了通过组合这些不同的突变酶而获得的过量生产酪氨酸的大肠杆菌(e.coli)菌株。这些菌株用于生产苯丙素类，例如香豆酸(kang等人，2012年)，或柚皮素，特别是通过除arogfbr和tyrafbr突变外突变rpoa基因(santos等人，2011年)。
15、在文章“大肠杆菌中l-酪氨酸生产的模块化工程(modular engineering of l-tyrosine production in e.coli)”中描述了为获得过量生产酪氨酸的大肠杆菌(e.coli)菌株而进行的修饰的综述(juminaga等人，2011年)。
16、正如rodriguez等人，2015年所述，苯丙素类化合物也已从过表达酪氨酸的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株中合成。
17、文献gb 2 416 769描述了使用含有编码酶4cl和bas的基因的微生物生产覆盆子酮的可能性，其中至少一种酶来自异源。优选的微生物是大肠杆菌(e.coli)(菌株bl21)，并且还可包含编码bar、c4h、pal和/或chs的序列，其中编码bar的序列有利地是内源性的。
18、然而，大肠杆菌(e.coli)或酿酒酵母(s.cerevisiae)似乎对苯丙素类化合物的毒性没有良好的耐受性，因此不是最适合生产苯丙素类化合物的微生物。
19、假单胞菌属(pseudomonas)的细菌对这些高毒性分子的耐受性更强，特别是恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)(calero等人，2017年)。然而，尚未详细描述恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)中参与生产芳香族氨基酸的酶。
20、因此，在恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)中过量生产莽草酸途径衍生物(例如酪氨酸)涉及使用源自大肠杆菌(e.coli)的arogfbr和tyrafbr突变体，但这并不特别有效(calero等人，2016年)。
21、描述了在台湾假单胞菌(pseudomonas taiwanensis)vlb120中，通过在trpep290s、arof-ip148l和pheat310i这3个基因中实施点突变来过量生产酪氨酸和苯酚(wynands等人，《代谢工程学》201本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种遗传修饰的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)菌株，其特征在于，所述菌株包含编码3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(DAHP)合酶的突变AroF-I基因，所述3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(DAHP)合酶的序列与序列SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性，并且具有至少一个P160L突变、P160L/Q164A双突变或P160L/S193A双突变，优选P160L/S193A双突变。
2.根据权利要求1所述的遗传修饰的恶臭假单胞菌菌株，其特征在于，所述菌株能够表达对酪氨酸反馈抑制具有抗性的重组DAHP合酶。
3.根据权利要求1或2所述的遗传修饰的菌株，其特征在于，所述菌株包含编码苯丙氨酸羟化酶(phhA)的附加重组基因以及编码四氢生物蝶呤脱水酶(phhB)的附加重组基因，所述苯丙氨酸羟化酶的序列与序列SEQ ID NO:5具有至少80％的同一性，所述四氢生物蝶呤脱水酶的序列与序列SEQ ID NO:6具有至少80％的同一性；优选地将重组基因phhA和phhB置于异源启动子的控制下，使得它们能够过表达。
4.
5.根据权利要求4所述的遗传修饰的菌株，其特征在于，所述菌株表达具有由序列SEQID NO:2、序列SEQ ID NO:3或序列SEQ ID NO:4定义的氨基酸序列的DAHP合酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的遗传修饰的菌株，其特征在于，所述菌株还包含选自以下的一种或多种附加重组基因：
7.根据权利要求1至6中任一项所述的遗传修饰的菌株，其特征在于，所述菌株能够生产苯丙素类化合物，优选香豆酸、对香豆酰辅酶A、4-羟基亚苄基丙酮或覆盆子酮。
8.一种用于合成苯丙素类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括在能够表达合成所述苯丙素类化合物所需的重组基因的条件下在培养基中使权利要求7所述的遗传修饰的菌株生长的步骤，所述苯丙素类化合物由所述遗传修饰的菌株合成。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述培养基中回收所述苯丙素类化合物的步骤。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的菌株用于合成苯丙素类化合物或苯丙素类衍生物、优选香豆酸或覆盆子酮的用途。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种遗传修饰的恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)菌株，其特征在于，所述菌株包含编码3-脱氧-d-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(dahp)合酶的突变arof-i基因，所述3-脱氧-d-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(dahp)合酶的序列与序列seq id no:1具有至少90％的同一性，并且具有至少一个p160l突变、p160l/q164a双突变或p160l/s193a双突变，优选p160l/s193a双突变。
2.根据权利要求1所述的遗传修饰的恶臭假单胞菌菌株，其特征在于，所述菌株能够表达对酪氨酸反馈抑制具有抗性的重组dahp合酶。
3.根据权利要求1或2所述的遗传修饰的菌株，其特征在于，所述菌株包含编码苯丙氨酸羟化酶(phha)的附加重组基因以及编码四氢生物蝶呤脱水酶(phhb)的附加重组基因，所述苯丙氨酸羟化酶的序列与序列seq id no:5具有至少80％的同一性，所述四氢生物蝶呤脱水酶的序列与序列seq id no:6具有至少80％的同一性；优选地将重组基因phha和phhb置于异源启动子的控制下，使得它们能够过表达。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的遗传修饰的菌株，其特征在于，所述菌株表达具有与序列se...
【专利技术属性】
技术研发人员：W·梅雷，R·德·安德雷德，C·朗凯，
申请(专利权)人：B基因遗传学公司，
类型：发明
国别省市：
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