【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、基因编辑技术的进步(诸如crispr-cas系统在真核生物中的应用和碱基编辑的出现)使得基因组能够在多种细胞类型和生物体中进行有效编辑，从而迅速扩展了治疗人遗传性疾病的可用方法。尽管crispr-cas系统和碱基编辑器对感兴趣的基因组靶标具有高度特异性，但优选地在细胞中瞬时表达基因组修饰工具，以便减轻如果表达持续超过较长时间段则更有可能发生的潜在脱靶编辑事件。因此，在成功中靶编辑后随后抑制或停止编辑活性的方法引起了广泛的兴趣，特别是当利用可能导致长期表达的递送方法，诸如通过腺相关病毒(aav)转导、dna转染或其他方法时。
技术实现思路
1、如下所述，本专利技术的特征在于自失活碱基编辑器和相关组合物和方法。
2、在一方面，本公开的专利技术特征在于一种多核苷酸，其编码脱氨酶结构域或核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域或其片段。多核苷酸含有内含子。将内含子插入在编码脱氨酶或napdnabp或其片段的开放阅读框中。
3、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种含有内含子的多核苷酸，其编码脱氨酶结构域或核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域开放阅读框。内含子在剪接受体或剪接供体位点处含有改变。所述改变减少或消除碱基编辑器mrna的剪接，从而减少或消除了碱基编辑器多肽的表达。
4、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种多核苷酸，其编码碱基编辑器多肽或其片段。多核苷酸含有内含子。将内含子插入在编码碱基编辑器多肽或其
5、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种多核苷酸，其包含含有内含子的碱基编辑器开放阅读框。内含子在剪接受体或剪接供体位点处含有改变。所述改变减少或消除碱基编辑器mrna的剪接，从而减少或消除了碱基编辑器多肽的表达。
6、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种多核苷酸，其编码含有核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域或脱氨酶结构域的碱基编辑器。多核苷酸含有内含子。将内含子插入在编码napdnabp结构域或脱氨酶的开放阅读框中。
7、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种多核苷酸，其编码含有核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域和脱氨酶结构域或其片段的碱基编辑器。多核苷酸包含含有内含子的碱基编辑器开放阅读框。内含子在剪接受体或剪接供体位点处含有改变。所述改变减少了碱基编辑器mrna的剪接。
8、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种组合物，其含有(i)编码脱氨酶结构域和核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域的n端片段的第一多核苷酸，其中所述napdnabp结构域的n端片段与分裂内含肽-n融合。组合物还含有(ii)编码所述napdnabp结构域的c端片段的第二多核苷酸，其中所述napdnabp结构域的c端片段与分裂内含肽-c融合。第一多核苷酸或第二多核苷酸含有内含子，其中所述内含子插入在所述多核苷酸的开放阅读框中。
9、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种组合物，其含有(i)编码脱氨酶结构域的n端片段的第一多核苷酸，其中所述脱氨酶结构域的n端片段与分裂内含肽-n融合。组合物还含有(ii)编码所述脱氨酶结构域的c端片段和核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域的第二多核苷酸，其中所述脱氨酶结构域的c端片段与分裂内含肽-c融合。第一多核苷酸或第二多核苷酸含有内含子，其中所述内含子插入在所述多核苷酸的开放阅读框中。
10、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种碱基编辑器系统，其含有(i)编码含有脱氨酶结构域的碱基编辑器或其片段的多核苷酸。碱基编辑器系统还含有(ii)引导所述碱基编辑器编辑细胞基因组中的位点的一种或多种指导rna。碱基编辑器系统还含有(iii)引导碱基编辑器编辑编码所述碱基编辑器的多核苷酸的一种或多种指导rna。所述编辑导致所编码的碱基编辑器的活性和/或表达降低。
11、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种碱基编辑器系统，其含有(i)编码自失活碱基编辑器或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含插入在所述自失活碱基编辑器或其片段的开放阅读框中的内含子。碱基编辑器系统还含有(ii)引导所述自失活碱基编辑器编辑细胞基因组中的位点的一种或多种指导rna。碱基编辑器系统还含有(iii)引导所述自失活碱基编辑器编辑存在于编码所述自失活碱基编辑器的多核苷酸的内含子中的剪接受体或剪接供体位点的一种或多种指导rna。
12、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种碱基编辑器系统，其含有(i)以上任一方面的编码碱基编辑器的多核苷酸。碱基编辑器系统还含有(ii)引导所述碱基编辑器编辑细胞基因组中的位点的一种或多种指导rna。碱基编辑器系统还含有(iii)引导所述碱基编辑器编辑存在于编码所述碱基编辑器的多核苷酸的内含子中的剪接受体或剪接供体位点的一种或多种指导rna。
13、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种碱基编辑器系统，其含有(i)以上任一方面的编码碱基编辑器的组合物。碱基编辑器系统还含有(ii)引导所述碱基编辑器编辑细胞基因组中的位点的一种或多种指导rna。碱基编辑器系统还含有(iii)引导所述碱基编辑器编辑存在于(i)的组合物的内含子中的剪接受体或剪接供体位点的一种或多种指导rna。
14、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种碱基编辑器系统，其含有(i)编码脱氨酶结构域和核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域的n端片段的第一多核苷酸，其中所述napdnabp结构域的n端片段与分裂内含肽-n融合。碱基编辑器系统还含有(ii)编码所述napdnabp结构域的c端片段的第二多核苷酸，其中所述napdnabp结构域的c端片段与分裂内含肽-c融合。第一多核苷酸或第二多核苷酸含有内含子，其中所述内含子插入在开放阅读框中，并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸编码碱基编辑器。碱基编辑器系统还含有(iii)引导所述碱基编辑器编辑细胞基因组中的位点的一种或多种指导rna。碱基编辑器系统还含有(iv)引导所述碱基编辑器编辑存在于(i)或(ii)的多核苷酸的内含子中的剪接受体或剪接供体位点的一种或多种指导rna。
15、在另一方面，本公开的专利技术特征在于一种碱基编辑器系统，其含有(i)编码脱氨酶结构域的n端片段的第一多核苷酸，其中所述脱氨酶结构域的n端片段与分裂内含肽-n融合。碱基编辑器系统还含有(ii)编码所述脱氨酶结构域的c端片段和核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域的第二多核苷酸，其中所述脱氨酶结构域的c端片段与分裂内含肽-c融合。第一多核苷酸或第二多核苷酸含有内含子，其中所述内含子插入在开放阅读框中，并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸编码碱基编辑器。碱基编辑器系统还含有(iii)引导所述碱基编辑器编辑细胞基因组中的位点的一种或多种指导rna。碱基编辑器系统还含有(iv)引导所述碱基编辑器编辑存在于(i)或(ii)的多核苷酸的内含子中的剪接受体或剪接供体位点的一种或多种指本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多核苷酸，其编码脱氨酶结构域或核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)结构域或其片段，所述多核苷酸包含内含子，其中所述内含子插入在编码所述脱氨酶或napDNAbp或其片段的开放阅读框中。
2.一种包含内含子的多核苷酸，其编码脱氨酶结构域或核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)结构域开放阅读框，所述内含子包含剪接受体或剪接供体位点处的改变，其中所述改变减少或消除碱基编辑器mRNA的剪接，从而减少或消除碱基编辑器多肽的表达。
3.一种多核苷酸，其编码碱基编辑器多肽或其片段，所述多核苷酸包含内含子，其中所述内含子插入在编码所述碱基编辑器多肽或其片段的开放阅读框中。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其中所述碱基编辑器在基因组DNA中具有高编辑效率。
5.一种多核苷酸，其包含含有内含子的碱基编辑器开放阅读框，所述内含子包含剪接受体或剪接供体位点处的改变，其中所述改变减少或消除碱基编辑器mRNA的剪接，从而减少或消除碱基编辑器多肽的表达。
6.如权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述碱基编辑器包含核酸可编程
7.一种多核苷酸，其编码包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)结构域或脱氨酶结构域的碱基编辑器，所述多核苷酸包含内含子，其中所述内含子插入在编码所述napDNAbp结构域或所述脱氨酶结构域的开放阅读框中。
8.一种多核苷酸，其编码包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)结构域和脱氨酶结构域或其片段的碱基编辑器，所述多核苷酸包含有包含内含子的碱基编辑器开放阅读框，所述内含子包含剪接受体或剪接供体位点处的改变，其中所述改变减少所述碱基编辑器mRNA的剪接。
9.如权利要求1、2或6-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述脱氨酶结构域是胞苷脱氨酶结构域或腺苷脱氨酶结构域。
10.如权利要求1、2或6-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述napDNAbp结构域是选自由Cas9、Cas12a/Cpf1、Cas12b/C2c1、Cas12c/C2c3、Cas12d/CasY、Cas12e/CasX、Cas12g、Cas12h、Cas12i和Cas12j/CasΦ结构域组成的组的Cas结构域。
11.如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于选自由NF1、PAX2、EEF1A1、HBB、IGHG1、SLC50A1、ABCB11、BRSK2、PLXNB3、TMPRSS6、IL32、ANTXRL、PKHD1L1、PADI1、KRT6C和HMCN2组成的组的序列。
12.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于NF1。
13.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于PAX2。
14.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于EEF1A1。
15.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于HBB。
16.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于IGHG1。
17.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于SLC50A1。
18.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于ABCB11。
19.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于BRSK2。
20.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于PLXNB3。
21.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于TMPRSS6。
22.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于IL32。
23.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于PKHD1L1。
24.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于PADI1。
25.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于KRT6C。
26.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于HMCN2。
27.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子与天然存在于哺乳动物基因中的内含子具有至少约85％核酸序列同一性。
28.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子与天然存在于非哺乳动物基因中的内含子具有至少约85％核酸序列同一性。
29.如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子是合成内含子。
30.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种多核苷酸，其编码脱氨酶结构域或核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域或其片段，所述多核苷酸包含内含子，其中所述内含子插入在编码所述脱氨酶或napdnabp或其片段的开放阅读框中。
2.一种包含内含子的多核苷酸，其编码脱氨酶结构域或核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域开放阅读框，所述内含子包含剪接受体或剪接供体位点处的改变，其中所述改变减少或消除碱基编辑器mrna的剪接，从而减少或消除碱基编辑器多肽的表达。
3.一种多核苷酸，其编码碱基编辑器多肽或其片段，所述多核苷酸包含内含子，其中所述内含子插入在编码所述碱基编辑器多肽或其片段的开放阅读框中。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其中所述碱基编辑器在基因组dna中具有高编辑效率。
5.一种多核苷酸，其包含含有内含子的碱基编辑器开放阅读框，所述内含子包含剪接受体或剪接供体位点处的改变，其中所述改变减少或消除碱基编辑器mrna的剪接，从而减少或消除碱基编辑器多肽的表达。
6.如权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述碱基编辑器包含核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域或脱氨酶结构域。
7.一种多核苷酸，其编码包含核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域或脱氨酶结构域的碱基编辑器，所述多核苷酸包含内含子，其中所述内含子插入在编码所述napdnabp结构域或所述脱氨酶结构域的开放阅读框中。
8.一种多核苷酸，其编码包含核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域和脱氨酶结构域或其片段的碱基编辑器，所述多核苷酸包含有包含内含子的碱基编辑器开放阅读框，所述内含子包含剪接受体或剪接供体位点处的改变，其中所述改变减少所述碱基编辑器mrna的剪接。
9.如权利要求1、2或6-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述脱氨酶结构域是胞苷脱氨酶结构域或腺苷脱氨酶结构域。
10.如权利要求1、2或6-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述napdnabp结构域是选自由cas9、cas12a/cpf1、cas12b/c2c1、cas12c/c2c3、cas12d/casy、cas12e/casx、cas12g、cas12h、cas12i和cas12j/casφ结构域组成的组的cas结构域。
11.如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于选自由nf1、pax2、eef1a1、hbb、ighg1、slc50a1、abcb11、brsk2、plxnb3、tmprss6、il32、antxrl、pkhd1l1、padi1、krt6c和hmcn2组成的组的序列。
12.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于nf1。
13.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于pax2。
14.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于eef1a1。
15.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于hbb。
16.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于ighg1。
17.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于slc50a1。
18.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于abcb11。
19.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于brsk2。
20.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于plxnb3。
21.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于tmprss6。
22.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于il32。
23.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于pkhd1l1。
24.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于padi1。
25.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于krt6c。
26.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述内含子来源于hmcn2。
27.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子与天然存在于哺乳动物基因中的内含子具有至少约85％核酸序列同一性。
28.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子与天然存在于非哺乳动物基因中的内含子具有至少约85％核酸序列同一性。
29.如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子是合成内含子。
30.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子包含与以下之一具有至少约85％核酸序列同一性的序列：
31.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子包含来自以下之一的核酸序列：
32.如权利要求1-31中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子包含约10个碱基对至约500个碱基对。
33.如权利要求32所述的多核苷酸，其中所述内含子包含约70个碱基对至150个碱基对。
34.如权利要求32所述的多核苷酸，其中所述内含子包含约100个碱基对至200个碱基对。
35.如权利要求1-34中任一项所述的多核苷酸，其中所述内含子插入到原型间隔区序列附近。
36.如权利要求35所述的多核苷酸，其中所述内含子插入在所述原型间隔区序列的约10至30个碱基对内。
37.如权利要求35或36所述的多核苷酸，其中所述原型间隔区序列是ngg或nngrrt。
38.如权利要求1、2或6-37中任一项所述的多核苷酸，其中所述脱氨酶结构域包含tada结构域。
39.如权利要求38所述的多核苷酸，其中所述内含子插入到tada的密码子18、23、59、62、87或129内或紧接其后插入。
40.如权利要求39所述的多核苷酸，其中所述内含子紧接tada的密码子87之后插入。
41.如权利要求2、5或8中任一项所述的多核苷酸，其中所述改变是单碱基编辑。
42.如权利要求41所述的多核苷酸，其中所述单碱基编辑是a到g碱基编辑。
43.如权利要求41所述的多核苷酸，其中所述单碱基编辑是c到t碱基编辑。
44.如权利要求1-43中任一项所述的多核苷酸，其还包含编码接头的多核苷酸序列。
45.如权利要求44所述的多核苷酸，其中所述内含子插入在编码所述接头的所述多核苷酸序列内。
46.如权利要求1-45中任一项所述的多核苷酸，其中所述可编程dna结合蛋白结构域是cas9结构域。
47.如权利要求46所述的多核苷酸，其中所述cas9结构域在对应于cas9的asn309和thr310的氨基酸残基之间分裂，并且残基310突变为thr310cys。
48.一种组合物，其包含：
49.一种组合物，其包含：(i)编码脱氨酶结构域的n端片段的第一多核苷酸，其中所述脱氨酶结构域的所述n端片段与分裂内含肽-n融合，以及(ii)编码所述脱氨酶结构域的c端片段和核酸可编程dna结合蛋白(napdnabp)结构域的第二多核苷酸，其中所述脱氨酶结构域的所述c端片段与分裂内含肽-c融合；
50.如权利要求48或49中任一项所述的组合物，其中所述内含子包含剪接受体或剪接供体位点处的改变，其中所述改变减少或消除碱基编辑器mrna的剪接。
51.如权利要求48-50中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶结构域是胞苷脱氨酶结构域或腺苷脱氨酶结构域。
52.如权利要求48-51中任一项所述的组合物，其中所述脱氨酶结构域是tada结构域。
53.如权利要求48-52中任一项所述的组合物，其中所述napdn abp结构域是选自由cas9、cas12a/cpf1、cas12b/c2c1、cas12c/c2c3、cas12d/casy、cas12e/casx、cas12g、cas12h、cas12i和cas12j/casφ结构域组成的组的cas结构域。
54.如权利要求48-53中任一项所述的组合物，其中所述napdnabp结构域是cas9区域。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述cas9结构域的n端结构域和c端结构域在氨基酸残基asn309和thr310之间分裂。
56.如权利要求54或55所述的组合物，其中所述cas9结构域包含突变thr310cys。
57.如权利要求48-56中任一项所述的组合物，其中所述内含子来源于选自由nf1、pax2、eef1a1、hbb、ighg1、slc50a1、abcb11、brsk2、plxnb3、tmprss6、il32、antxrl、pkhd1l1、padi1、krt6c和hmcn2组成的组的序列。
58.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于nf1。
59.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于pax2。
60.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于eef1a1。
61.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于hbb。
62.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于ighg1。
63.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于slc50a1。
64.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于abcb11。
65.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于brsk2。
66.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于plxnb3。
67.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于tmprss6。
68.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于il32。
69.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于pkhd1l1。
70.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于padi1。
71.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于krt6c。
72.如权利要求57所述的组合物，其中所述内含子来源于hmcn2。
73.如权利要求48-72中任一项所述的组合物，其还包含接头多核苷酸序列。
74.如权利要求73所述的组合物，其中所述内含子插入在所述接头多核苷酸序列内。
75.一种碱基编辑器系统，其包含：
76.如权利要求75所述的碱基编辑器系统，其中所述编辑改变所述脱氨酶结构域的催化残基。
77.如权利要求75或权利要求76所述的碱基编辑器，其中所述脱氨酶结构域是腺苷脱氨酶结构域。
78.如权利要求75或权利要求76所述的碱基编辑器，其中所述脱氨酶结构域是胞苷脱氨酶结构域。
79.如权利要求77所述的碱基编辑器系统，其中所述脱氨酶结构域的所述改变的催化残基是以下参考序列的his57(h57)、glu59(e59)、cys87(c87)或cys90(c90)：
80.如权利要求76或权利要求79所述的碱基编辑器系统，其中所述改变的催化残基是e59。
81.如权利要求76或权利要求79所述的碱基编辑器，其中对所述催化残基的所述改变是e59g。
82.如权利要求76或权利要求79所述的碱基编辑器系统，其中所述改变的催化残基是h57。
83.如权利要求76或权利要求79所述的碱基编辑器，其中对所述催化残基的所述改变是h57r。
84.如权利要求76或权利要求79所述的碱基编辑器系统，其中所述改变的催化残基是c87。
85.如权利要求76或权利要求79所述的碱基编辑器，其中对所述催化残基的所述改变是c87r。
86.如权利要求76或权利要求79所述的碱基编辑器系统，其中所述改变的催化残基是c90。
87.如权利要求76或权利要求79所述的碱基编辑器，其中对所述催化残基的所述改变是c90r。
88.一种碱基编辑器系统，其包含：
89.一种碱基编辑器系统，其包含：
90.一种碱基编辑器系统，其包含：
91.一种碱基编辑器系统，其包含：
92.一种碱基编辑器系统，其包含：
93.如权利要求75-92中任一项所述的碱基编辑器系统，其中所述碱基编辑器系统包含选自以下的多核苷酸序列：
94.一种载体，其包含编码自失活碱基编辑器或其片段的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含插入在自失活碱基编辑器或其片段的开放阅读框中的内含子。
95.一种载体，...
【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·布赖森，杰克·苏利文，
申请(专利权)人：比姆医疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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