【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于石斛品种鉴定，具体涉及一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法。
技术介绍
1、铁皮石斛(dendrobium officinale kimura et migo，d.officinale)和霍山石斛(dendrobium huoshanense c.z.tang et s.j.cheng)为兰科石斛属多年生草本植物，具有滋养阴津、提高免疫力、抗氧化、促进消化等功能，作为名贵中药材，有着悠久的药用历史。由于铁皮石斛和霍山石斛药用价值高，市场需求量大，价格节节攀升，高昂的价格和稀缺的资源，导致其市场以假充真、以次充好的现象非常严重。石斛产品经营主体多而杂，竞争无序，加之石斛品种繁多，不同石斛品种形态相似，难以区分，以伪品(如石仙桃等)或其他价值较低的石斛产品(如齿瓣石斛、流苏石斛等)冒充铁皮石斛或霍山石斛流入市场非常普遍。尤其是以铁皮石斛和霍山石斛为原料的保健食品，由于经过深加工，丧失了原有形态特征，传统方法更难加以鉴别，假冒伪劣现象更为严重，无法保证其疗效和食用安全。
2、目前铁皮石斛、霍山石斛及其伪品的鉴定多采用性状鉴定、显微鉴定、化学鉴定等。其中传统的性状鉴定和显微鉴定，建立于个体形态描述和微观观测水平，对于检验人员的经验、技术要求很高，且得到的结论往往不够完善，特别是对于加工后丧失铁皮石斛形态的粉末或液体制剂很难进行有效鉴定。化学鉴定主要包括一般理化鉴定、光谱鉴定、色谱鉴定等，影响因素较多，易受外界因素及生物体发育阶段的影响。目前主要以多糖和甘露糖为指标对铁皮石斛进行质量控制
3、目前石斛的分子鉴别方法中以核酸检测法为基础的pcr法应用最为广泛，其常用的技术方法包括普通定性pcr、巢式pcr、多重pcr、荧光定量pcr等。普通定性pcr法检测效率低，尤其检测多基因对象时更加费时费力；巢式pcr虽然提高了检测的灵敏度，但同样存在检测效率的问题；多重pcr方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但因扩增效率限制，目前针对铁皮石斛的多重pcr报道仅有三重检测方法，一次检测靶点有限；荧光定量pcr法虽然灵敏度高，但难以区分铁皮石斛的混伪品。此外，dna条形码技术的应用也较为广泛，该技术虽然可以准确地鉴定铁皮石斛并对其进行聚类区分，但其检测过程涉及了pcr扩增、电泳检测、pcr产物纯化、pcr扩增片段测序、测序结果拼接及序列比对分析等一系列步骤，操作繁琐，专业度高，不适用于快速检验及基层检验的推广应用；且dna条形码技术仅适用于单一来源样品，无法对多种石斛来源的混伪品进行检测。因此，亟需建立一种可同时鉴别多种石斛的检测方法，为石斛市场掺伪监测提供有力手段。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，该方法可在3小时内完成石斛属、铁皮石斛、霍山石斛、流苏石斛、齿瓣石斛和石仙桃等源性成分的快速筛查，具有良好的重复性性、特异性和灵敏度，本方法对靶标dna核酸的整体检测限为0.1ng/μl，对铁皮石斛中霍山石斛、流苏石斛、齿瓣石斛和石仙桃的掺伪检出限为1％(质量比)，对霍山石斛中铁皮石斛、流苏石斛、齿瓣石斛和石仙桃的掺伪检出限为1％(质量比)，可满足市场的检测需求。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，该检测方法包括如下步骤：
4、s01、pcr引物及探针设计
5、从数据库中筛选出铁皮石斛、霍山石斛及其常见混伪品的保守基因和特异性基因，分别选取铁皮石斛的its序列和霍山石斛的trnl-trnf序列设计两对特异性引物及对应探针。
6、同时使用一对its通用引物对流苏石斛、齿瓣石斛、石仙桃及石斛属进行扩增，针对扩增产物分别设计特异性探针。
7、对上述得到的所有引物进行5’-biotin修饰，对探针进行5’-nh2c6修饰，得到引物组和探针组。
8、s02、pcr扩增
9、同时使用铁皮石斛和霍山石斛双重pcr体系和its通用pcr体系对样品进行pcr扩增，得到pcr产物。
10、s03、膜芯片制备
11、按1.1cm×1.1cm尺寸裁好尼龙膜条，在双蒸水和15×ssc中分别浸泡15min，取出置于滤纸上60℃烘干，各探针按膜芯片探针布局图依次点制，得到检测用基因膜芯片。
12、s04、杂交显色
13、pcr产物于95℃解链变性5min后，低温放置3min以上，得到pcr变性产物；
14、吸取20μl pcr变性产物至200μl杂交液中，由mfs-24基因膜芯片检测工作站按下述杂交流程进行杂交及显色反应，经化学显色反应，可直观显示检测结果。
15、作为优选：在步骤s01中，pcr引物及探针的信息为：
16、
17、作为优选：铁皮石斛和霍山石斛双重pcr体系的扩增条件为：依次加入10×pcrbuffer 2.5μl、du plus dntp(12.5×)2μl、tpf(10μmol/l)0.45μl、tpr(10μmol/l)0.3μl、hsf(10μmol/l)0.6μl、hsr(10μmol/l)0.4μl、25mm mgcl2 0.75μl、ung(2u/μl)0.25μl、taq(5u/μl)0.3μl、模板dna50～200ng，ddh2o补足25μl，25℃10min；95℃5min；95℃20s,61℃30s,72℃60s,35个循环；72℃延伸3min；12℃/4℃保温。
18、作为优选：its通用pcr体系的扩增条件为：依次加入10×pcr buffer 2.5μl、duplus dntp(12.5×)2μl、its2f(10μmol/l)0.75μl、its3r(10μmol/l)0.5μl、25mm mgcl20.75μl、ung(2u/μl)0.25μl、taq(5u/μl)0.3μl、模板dna 50～200ng，ddh2o补足25μl，25℃10min；95℃5min；95℃20s,61℃30s,72℃60s,35个循环；72℃延伸3min；12℃/4℃保温。
19、作为优选：在步骤s03中，内参及各检测靶标探针浓度为10～20μmol/l，阳性及阴性探针浓度为5μmol/l。
20、作为优选：在步骤s01中，数据库选自genbank、pubmed和cnki中的至少一种。
21、作为优选：在步骤s04中，膜芯片杂交包括手动杂交和自动杂交，其中手动杂交的步骤为：
22、将固定有核酸探针的膜芯片放入杂交盒中，芯片标签正面朝上，加入去活化液1ml，37℃孵育8min；加入去活化清洗液1ml，60℃孵育5min；吸除去活化清洗液，加入杂交体系液1ml，42℃水平摇床90rpm孵育45min；吸除杂交体系液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：在步骤S01中，PCR引物及探针的信息为：
3.根据权利要求1所述的一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：铁皮石斛和霍山石斛双重PCR体系的扩增条件为：依次加入10×PCR Buffer 2.5μL、dU plus dNTP(12.5×)2μL、TPF(10μmol/L)0.45μL、TPR(10μmol/L)0.3μL、HSF(10μmol/L)0.6μL、HSR(10μmol/L)0.4μL、25mM MgCl2 0.75μL、UNG(2U/μL)0.25μL、Taq(5U/μL)0.3μL、模板DNA 50～200ng，ddH2O补足25μL，25℃10min；95℃5min；95℃20s,61℃30s,72℃60s,35个循环；72℃延伸3min；12℃/4℃保温。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测铁皮
5.根据权利要求1所述的一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：在步骤S03中，内参及各检测靶标探针浓度为10～20μmol/L，阳性探针浓度为5μmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：在步骤S01中，数据库选自GenBank、PubMed和CNKI中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：在步骤S04中，膜芯片杂交包括手动杂交和自动杂交，其中手动杂交的步骤为：
8.根据权利要求7所述的一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：自动杂交的步骤为：
...【技术特征摘要】
1.一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：在步骤s01中，pcr引物及探针的信息为：
3.根据权利要求1所述的一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：铁皮石斛和霍山石斛双重pcr体系的扩增条件为：依次加入10×pcr buffer 2.5μl、du plus dntp(12.5×)2μl、tpf(10μmol/l)0.45μl、tpr(10μmol/l)0.3μl、hsf(10μmol/l)0.6μl、hsr(10μmol/l)0.4μl、25mm mgcl2 0.75μl、ung(2u/μl)0.25μl、taq(5u/μl)0.3μl、模板dna 50～200ng，ddh2o补足25μl，25℃10min；95℃5min；95℃20s,61℃30s,72℃60s,35个循环；72℃延伸3min；12℃/4℃保温。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测铁皮石斛、霍山石斛及其常见伪品的基因膜芯片检测方法，其特征在于：its通用pcr体系的扩增条件为：依次加入10×pcr buffer 2.5μl...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘映秋，洪亮，夏慧丽，卢启寰，李兆奎，
申请(专利权)人：台州市食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：
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