【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及组织病理学与生物，特别是涉及一种用于类器官回收固定的石蜡切片包埋方法。
技术介绍
1、现有技术制备类器官回收固定的石蜡切片普遍采用琼脂糖法，目前较为常用的方法如下：
2、一、类器官收集
3、1、类器官收集(例如24孔板，收集1～2孔类器官，大约200～500个类器官)；
4、2、4℃静置10min，离心弃去大部分上清。
5、二、琼脂糖凹槽制备
6、1、称量0.2～0.4g琼脂糖，加入至烧杯或者小试剂瓶内；
7、2、加入10ml左右pbs；
8、3、微波炉高火融化，每隔5s暂停打开，观察，重复数次至琼脂糖融化完全；
9、4、取200μl融化琼脂糖，加入至600μl 1.5ml ep管内(如图1所示)；
10、5、在盛有琼脂糖的1.5ml ep管内插入一小0.5ml ep管，使琼脂糖形成一圆尖底凹槽，室温或者4℃冰箱静置数分钟，至琼脂糖凝固，轻轻转动小0.5ml ep管，取出0.5ml ep管，可看到琼脂糖内形成一个深圆尖底槽；
11、6、吸取类器官沉淀置于凹槽底部，尽量包埋在中间位置；
12、7、加入pbs至高于琼脂糖槽的边缘。
13、三、类器官固定
14、如图2所示，进行类器官固定。
15、四、类器官包埋
16、1、脱水：取出已凝固的含有类器官沉淀的琼脂糖块，在梯度乙醇中脱水，70％、80％、90％和95％乙醇各1h，100％乙醇30mi
17、2、融蜡：提前4h左右打开烘箱，65℃溶蜡；
18、3、透明：将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒中(二甲苯处理前需一直浸泡在无水乙醇中)，将包埋盒转移至二甲苯中5min处理两次；注：因二甲苯有毒性，需在通风良好区域进行操作，取出时尽量沥尽残留二甲苯；
19、4、浸蜡：透明化处理完成后立即转入已经融化的蜡缸中，60℃浸蜡2h后，更换新的蜡缸再次浸蜡2h；
20、5、包埋：包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡倒入蜡盒三分之一处，将琼脂块放置于中间位置，然后再滴蜡包埋直到倒满。待蜡块完全凝固后，小心脱下模具。
21、然而该方法具有以下缺陷：
22、1、琼脂糖凹槽制备较为繁琐，煮沸的琼脂糖浓度无法精确，且如此高温环境极易破坏样品本身形态或者样品中核酸、蛋白等的分子结构；
23、2、琼脂糖凹槽制备时对套管要求较高，难以制备出完整、规则、对称的琼脂糖凹槽，且琼脂糖冷却时间较长，延误实验操作；
24、3、在琼脂糖凹槽中使用pbs重悬类器官容易对类器官造成机械损伤，离心弃去pbs时可能造成pbs残留过多或类器官大量丢失，补充添加的琼脂糖在接触凝固的琼脂糖时凝固过快，可使悬起的类器官分散，降低了切片上单位视野中的类器官数量，导致工作量增加；
25、4、琼脂糖的渗透率低，包埋在其中的类器官难以接受充分地固定、脱水、透明和浸蜡处理，导致切片难度大幅提升，图像质量大幅下降；
26、5、琼脂糖与石蜡相溶性差及水分透过率低的特点使包埋后琼脂糖与石蜡分离，较难甚至无法获得完整切片，且短时间的存放即致琼脂糖严重失水收缩，完全从石蜡中脱离(如图3所示)，包埋的蜡块彻底废弃，导致切片效率极低、技术要求极高、实验重复性极差的致命问题。
27、为了解决类器官等体外培养物的回收固定和石蜡包埋过程中易出现的丢失、脱落、及包埋与切片效果差的技术问题，本专利技术拟开发一种用于类器官回收固定的石蜡切片新型包埋方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种用于类器官回收固定的石蜡切片包埋方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法可以实现类器官的高效、高速和高质量回收固定及石蜡包埋，为类器官的切片技术提供最佳手段与前期保障。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种用于类器官回收固定的石蜡切片包埋方法，包括以下步骤：
4、通过溶解基质胶，将类器官释放于pfa固定液中，得到类器官的pfa悬液；
5、对所述类器官的pfa悬液进行脱水处理后，再经透明处理，之后离心得到类器官沉淀；
6、在所述类器官沉淀中加入融化的石蜡快速重悬，之后进行浸蜡处理，然后吸弃上清，用融化的石蜡再次快速重悬，转移至柱模中，之后凝固，脱模，得到柱形蜡块；
7、将所述柱形蜡块放入模具中，利用石蜡进行包埋，脱模以及切片处理，得到所述石蜡切片。
8、进一步地，所述pfa固定液的浓度为4wt％。
9、进一步地，所述溶解基质胶的温度为4℃。
10、进一步地，所述溶解基质胶的时间不低于1h。
11、进一步地，依次使用体积分数为70％、80％、90％和100％的乙醇溶液进行脱水处理。
12、进一步地，使用各浓度乙醇溶液进行脱水处理的时间均为1h。
13、进一步地，依次使用无水乙醇-二甲苯混合溶液和二甲苯进行透明处理。
14、进一步地，所述无水乙醇-二甲苯混合溶液中，无水乙醇和二甲苯的体积比为1:1。
15、进一步地，使用所述无水乙醇-二甲苯混合溶液和二甲苯进行透明处理的时间均为5min。
16、进一步地，所述柱模的材料为中硬度硅橡胶。
17、本专利技术公开了以下技术效果：
18、经本专利技术方法回收、固定和包埋的类器官可完全去除基质胶，释放的类器官完全回收于pfa中充分固定，相比于琼脂糖凹槽法，该方法使用pfa作为溶解介质，在溶解基质胶、释放类器官的同时固定类器官，避免了类器官从存活状态转为固定状态时发生的分子变化，在基质胶褪去的第一时间将类器官固定，保证了其原始形态。在脱水、透明和浸蜡的过程中，本专利技术的单一介质优势使类器官直接悬浮于乙醇、二甲苯或石蜡中，有效移除了其它介质对类器官和试剂的隔断，解决了二甲苯、石蜡难以渗透的问题，可将每一个类器官都完全地浸透石蜡，由于最终只有石蜡作为唯一介质，包埋后的类器官与石蜡好似天生一体，可较容易地切出既薄又完整、平整的切片，此外，在专用柱模的有利条件下，可将样品中的类器官汇聚在一起并均匀地分布在切面中，大幅提升切片效率及图像分析质量。
19、本专利技术完全舍弃了传统的琼脂糖凹槽包裹类器官的方法，使用更为简洁、先进，以及更符合组织病理学操作手段和原理的回收固定、脱水透明等处理方式，可使类器官样品接受充分地固定、脱水、透明和浸蜡处理，单一的包埋介质使切片效率和质量更加稳定，最终的图像与分析效果更加令人满意，本专利技术的方法结合专用柱模，使类器官样品在回收与包埋的过程中尽可能的保留，大大降低了丢失率，且可将更多的类器官汇聚在同一平面，大幅降低了切片难度，提高了结果分析时的可比性。
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1.一种用于类器官回收固定的石蜡切片包埋方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，所述PFA固定液的浓度为4wt％。
3.根据权利要求1所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，所述溶解基质胶的温度为4℃。
4.根据权利要求3所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，所述溶解基质胶的时间不低于1h。
5.根据权利要求1所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，依次使用体积分数为70％、80％、90％和100％的乙醇溶液进行脱水处理。
6.根据权利要求5所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，使用各浓度乙醇溶液进行脱水处理的时间均为1h。
7.根据权利要求1所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，依次使用无水乙醇-二甲苯混合溶液和二甲苯进行透明处理。
8.根据权利要求7所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，所述无水乙醇-二甲苯混合溶液中，无水乙醇和二甲苯的体积比为1:1。
9.根据权利要求8所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，使用所述无水乙醇-二甲苯混合溶液和二甲苯进行
10.根据权利要求1所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，所述柱模的材料为中硬度硅橡胶。
...【技术特征摘要】
1.一种用于类器官回收固定的石蜡切片包埋方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，所述pfa固定液的浓度为4wt％。
3.根据权利要求1所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，所述溶解基质胶的温度为4℃。
4.根据权利要求3所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，所述溶解基质胶的时间不低于1h。
5.根据权利要求1所述的石蜡切片包埋方法，其特征在于，依次使用体积分数为70％、80％、90％和100％的乙醇溶液进行脱水处理。
6.根据权利要求5所述的石蜡切片包埋...
【专利技术属性】
技术研发人员：金鑫，魏战勇，张曼，李庆豪，胡慧，孙娟，项玉强，夏璐，祖少坡，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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