【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体生物医学检测，尤其涉及一种新型冠状病毒抗体检测试纸及其制备方法。
技术介绍
1、新冠病毒是一种典型的β冠状病毒，国际病毒分类委员会将其命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)，其四种结构蛋白包括刺突蛋白(spike，s)、包膜蛋白(envelope，e)、膜蛋白(membrane m)和核衣壳蛋白(nucle ocapsil，n)，是病毒组装和生成结构完整的病毒颗粒所必需的。新冠病毒感染靶细胞是通过其表面的刺突蛋白s与细胞受体血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme2，ace2)特异性结合而完成的。刺突蛋白(s)是sars-cov-2的主要靶点，s1亚基中的rbd(receptor binding domain，rbd)结构域负责与ace2受体结合，s2亚基负责将s蛋白固定在宿主细胞膜上，以促进病毒进入宿主细胞。ace2作为受体介导sars-cov-2侵入宿主细胞。因此，阻断新冠病毒s蛋白与ace2特异性结合是一个重要的抗病毒干预手段，在对抗各类病毒性感染疾病时发挥重要作用。
2、新型冠状病毒中和抗体，可与s蛋白的rbd结合从而阻断病毒与人体ace2结合，表现出直接中和活性。目前在中和抗体检测中，主要通过真病毒或假病毒进行体外中和实验，检测技术水平要求高，且检测时间长，检测效率低。
3、为了提高检测效率，现有技术如cn 114594256 a公开的一种新型冠状病毒抗体检测方法及其试剂盒，利用胶体金免疫层析竞争法，将ace2蛋白标记上胶
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术灵敏度和准确度不高的问题，提出一种新型冠状病毒抗体检测试纸及其制备方法，提高了检测灵敏度和准确度，同时实现了半定量。
2、第一方面，本专利技术首先提供一种新型冠状病毒抗体检测试纸，由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，其中，所述胶体金垫包被有胶体金标记的covid-19重组rbd蛋白；所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线t1、检测线t2和质控线c，其中，所述检测线t1上包被有ace2蛋白，所述检测线t2上包被有covid-19重组rbd蛋白，所述质控线c上包被有兔抗covid-19重组rbd的单克隆抗体。
3、进一步地，所述ace2蛋白的基因序列如seq id no.1所示。
4、进一步地，所述covid-19重组rbd蛋白的基因序列如seq id no.2所示。
5、进一步地，所述胶体金标记的covid-19重组rbd蛋白的制备方法如下：
6、步骤1：将胶体金溶液进行搅拌，用0.2mol/l碳酸钾调节ph值至8.5，逐滴缓慢加入covid-19重组rbd蛋白，使蛋白的终浓度为10μg/ml，室温静置60分钟；
7、步骤2：将加入蛋白的胶体金溶液中加入10％的bsa溶液使其终浓度为1％，混匀后封闭30分钟或4℃过夜，7500r/min离心20分钟，弃上清，用金标缓冲液将离心的沉淀重悬，使其体积为原体积1/10，获得金标结合物，即胶体金标记的covid-19重组rbd蛋白。
8、进一步地，步骤1中胶体金溶液的制备方法为：0.01％氯金酸溶液加入经硅化处理过的玻璃容器中，置于磁力加热搅拌器上，煮沸3分钟后，在搅拌状态下迅速一次性加入1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热6～8分钟，冷却至室温后用纯化水恢复到100ml，用0.22μm滤膜过滤后装入洁净的玻璃瓶中，置于磁力搅拌器上，300g/min搅拌，用0.2mol/l碳酸钾溶液调节ph值至8.5，得到胶体金溶液。
9、进一步地，步骤2中所述金标缓冲液是由以下成分组成：0.02mol/lph7.2的pbs、终浓度1％的牛血白蛋白、终浓度0.5％的蔗糖和终浓度0.01％的叠氮钠。
10、进一步地，所述covid-19重组rbd蛋白，按照每1ml胶体金离心得到的金标结合物加入300μl金标抗原重悬液，混匀后喷涂在玻璃纤维膜上，喷涂量为25μl/cm2，金标抗原重悬液由以下成分组成：0.02mol/l ph7.2的pbs、终浓度1％的牛血白蛋白和终浓度0.5％的蔗糖。
11、进一步地，所述ace2蛋白用膜包被液稀释后，按照1.0μg/cm2喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线t1；所述rbd蛋白用膜包被液稀释后，按照1.0μg/cm2喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线t2；所述兔抗covid-19重组rbd的单克隆抗体按照1.0μg/cm2喷于硝酸纤维素膜上，作为质控线c；膜包被液由以下成分组成：0.02mol/l ph7.2的pbs和终浓度1.5％的蔗糖。
12、第二方面，本专利技术还提供了上述的新型冠状病毒抗体检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
13、s1、胶体金溶液的制备：0.01％氯金酸溶液加入经硅化处理过的玻璃容器中，置于磁力加热搅拌器上，煮沸3分钟后，在搅拌状态下迅速一次性加入1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热6～8分钟，冷却至室温后用纯化水恢复到100ml，用0.22μm滤膜过滤后装入洁净的玻璃瓶中，置于磁力搅拌器上，300g/min搅拌，用0.2mol/l碳酸钾溶液调节ph值至8.5，得到胶体金溶液；
14、s2、胶体金标记的covid-19重组rbd蛋白的制备：将胶体金溶液进行搅拌，用0.2mol/l碳酸钾调节ph值至8.5，逐滴缓慢加入covid-19重组rbd蛋白，使蛋白的终浓度为10μg/ml，室温静置60分钟；将加入蛋白的胶体金溶液中加入10％的bsa溶液使其终浓度为1％，混匀后封闭30分钟或4℃过夜，7500r/min离心20分钟，弃上清，用金标缓冲液将离心的沉淀重悬，使其体积为原体积1/10，获得金标结合物，即胶体金标记的covid-19重组rbd蛋白；
15、s3、胶体金垫的制备：每1ml胶体金离心得到的金标结合物加入300μl金标抗原重悬液，混匀后喷涂在玻璃纤维膜上，喷涂量为25μl/cm2，金标抗原重悬液由以下成分组成：0.02mol/l ph7.2的pbs、终浓度1％的牛血白蛋白和终浓度0.5％的蔗糖；
16、s4、硝酸纤维素膜的制备：将ace2蛋白用膜包被液稀释后，按照1.0μg/cm2喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线t1；将rbd蛋白用膜包被液稀释后，按照1.0μg/cm2喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线t2；将兔抗covid-19重组rbd的单克隆抗体按照1.0μg/cm2喷于硝酸纤维素膜上，作为质控线c；膜包被液由以下成分组成：0.02mol/l ph7.2的p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒抗体检测试纸，由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，其特征在于，所述胶体金垫包被有胶体金标记的COVID-19重组RBD蛋白；所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线T1、检测线T2和质控线C，其中，所述检测线T1上包被有ACE2蛋白，所述检测线T2上包被有COVID-19重组RBD蛋白，所述质控线C上包被有兔抗COVID-19重组RBD的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，所述ACE2蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，所述COVID-19重组RBD蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，所述胶体金标记的COVID-19重组RBD蛋白的制备方法如下：
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，步骤1中胶体金溶液的制备方法为：0.01％氯金酸溶液加入经硅化处理过的玻璃容器中，置于磁力加热搅拌器上，煮沸3分钟后，在搅
6.根据权利要求4所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，步骤2中所述金标缓冲液是由以下成分组成：0.02mol/L pH7.2的PBS、终浓度1％的牛血白蛋白、终浓度0.5％的蔗糖和终浓度0.01％的叠氮钠。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，所述COVID-19重组RBD蛋白，按照每1ml胶体金离心得到的金标结合物加入300μl金标抗原重悬液，混匀后喷涂在玻璃纤维膜上，喷涂量为25μl/cm2，金标抗原重悬液由以下成分组成：0.02mol/L pH7.2的PBS、终浓度1％的牛血白蛋白和终浓度0.5％的蔗糖。
8.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，所述ACE2蛋白用膜包被液稀释后，按照1.0μg/cm2喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线T1；所述RBD蛋白用膜包被液稀释后，按照1.0μg/cm2喷于硝酸纤维素膜上，作为检测线T2；所述兔抗COVID-19重组RBD的单克隆抗体按照1.0μg/cm2喷于硝酸纤维素膜上，作为质控线C；膜包被液由以下成分组成：0.02mol/L pH7.2的PBS和终浓度1.5％的蔗糖。
9.根据权利要求1-8任一项所述的新型冠状病毒抗体检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.一种新型冠状病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-8任一项所述的新型冠状病毒抗体检测试纸以及比色卡，所述比色卡的颜色按照由深至浅依次包括四个等级，分别对应新型冠状病毒中和抗体标准品的浓度为15ng/ml、30ng/ml、50ng/ml和100ng/ml。
...【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒抗体检测试纸，由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成，其特征在于，所述胶体金垫包被有胶体金标记的covid-19重组rbd蛋白；所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线t1、检测线t2和质控线c，其中，所述检测线t1上包被有ace2蛋白，所述检测线t2上包被有covid-19重组rbd蛋白，所述质控线c上包被有兔抗covid-19重组rbd的单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，所述ace2蛋白的基因序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，所述covid-19重组rbd蛋白的基因序列如seq id no.2所示。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，所述胶体金标记的covid-19重组rbd蛋白的制备方法如下：
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，步骤1中胶体金溶液的制备方法为：0.01％氯金酸溶液加入经硅化处理过的玻璃容器中，置于磁力加热搅拌器上，煮沸3分钟后，在搅拌状态下迅速一次性加入1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热6～8分钟，冷却至室温后用纯化水恢复到100ml，用0.22μm滤膜过滤后装入洁净的玻璃瓶中，置于磁力搅拌器上，300g/min搅拌，用0.2mol/l碳酸钾溶液调节ph值至8.5，得到胶体金溶液。
6.根据权利要求4所述的新型冠状病毒抗体检测试纸，其特征在于，步骤2中所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：石晶，刘立明，卢玉婷，李晶，刘馨璐，
申请(专利权)人：吉林农业科技学院，
类型：发明
国别省市：
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