【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
1.本专利技术总体上涉及分子生物学领域。更具体地，本专利技术涉及用于形成具有来自两种不同核酸分子的嵌合序列的扩增子的组合物和方法。2.相关技术的说明pcr和连接是测序文库制备中经常使用的方法，用于将衔接子序列附加到目标核酸序列的5'和3'端。这两种方法都有一些局限性。连接效率通常较低，在10％至30％之间，无法将衔接子序列添加到大多数分子中，导致这些分子丢失。pcr方法需要至少两个循环才能将衔接子序列附加到扩增子分子的两端。这意味着必须使用热稳定聚合酶，或者必须在第一个循环后将额外的聚合酶添加到反应中。需要能够克服热稳定聚合酶和热循环反应的局限性以及连接效率低的方法。
技术介绍
技术实现思路
1、在一个实施例中，本文提供了组合物，该组合物包括：(a)引物寡核苷酸，和(b)终止子寡核苷酸，其中终止子包括5'至3'的：(i)长度在5nt与200nt之间的第一序列，(ii)长度在3nt与50nt之间的第二序列，(iii)长度在3nt与70nt之间的环序列，(iv)长度在3nt与50nt之间的第三序列，其中第三序列与第二序列互补，以及(v)长度在6nt与500nt之间的第四序列，其中第四序列与靶核酸上的结合区序列互补，其中第三序列与位于靶核酸上结合区3'的匹配区序列互补，并且其中包括至少15个核苷酸的引物的3'子序列与位于靶核酸上匹配区3'的引发区序列(至少80％)互补。上述互补关系可以具有小于100％的互补性。在一些方面，上述互补关系具有≥95％、≥90％、≥85％或≥80％的互补性。在一些方面，组
2、在一个实施例中，本文提供了用于通过聚合酶延伸形成靶核酸的嵌合扩增子的组合物，其中靶核酸从5'至3'包括结合区、匹配区和引发区，该组合物包括终止子寡核苷酸，其中终止子包括5'至3'的：(a)长度在5nt与200nt之间的第一序列，(b)长度在3nt与50nt之间的第二序列，(c)长度在3nt与70nt之间的环序列，(d)长度在3nt与50nt之间的第三序列，其中第三序列与第二序列互补，以及(e)长度在6nt与500nt之间的第四序列，其中第四序列与靶核酸的结合区互补，并且其中第三序列与靶核酸的匹配区互补。在一些方面，组合物进一步包括引物寡核苷酸，其中包括至少15个核苷酸的引物的3'子序列与位于靶核酸上匹配区3'的引发区序列互补。上述互补关系可以具有小于100％的互补性。在一些方面，上述互补关系具有≥95％、≥90％、≥85％或≥80％的互补性。该组合物可用于形成具有来自靶核酸分子和终止子核酸分子的嵌合序列的扩增子。该组合物可用于通过聚合酶诱导模板转换。该组合物可用于制备测序文库。
3、在一些方面，组合物进一步包括靶核酸。在一些方面，匹配区的位置紧邻结合区的3'。在一些方面，匹配区与结合区相邻。
4、在一些方面，组合物进一步包括模板依赖性聚合酶。在一些方面，模板依赖性聚合酶是热稳定的。在一些方面，模板依赖性聚合酶不是热稳定的。
5、在一些方面，组合物进一步包括聚合酶实现功能所需的试剂和缓冲液。
6、在一些方面，引物包括与位于引发区3'的靶核酸区域不互补的5'子序列。在一些方面，引物包括与紧邻引发区3'的靶核酸区域不互补的5'子序列。在一些方面，引物包括与位于引发区3'的20个核苷酸区域内的靶核酸区域不互补的5'子序列。在一些方面，引物包括5'子序列，该5'子序列包括测序衔接子或索引序列。
7、在一些方面，终止子寡核苷酸进一步包括位于第二序列与环序列之间的第五序列，以及位于环序列与第三序列之间的第六序列，其中第五序列与第六序列互补。在一些方面，第六序列不与位于匹配区3'的靶核酸区域互补。在一些方面，第五序列不与紧邻匹配区3'的靶核酸区域互补。在一些方面，第五序列不与位于匹配区3'的20个核苷酸区域内的靶核酸区域互补
8、在一些方面，终止子寡核苷酸在3'端具有至少3个核苷酸长度的子序列，其不与靶标互补。在一些方面，3'端的子序列形成至少一个发夹结构。在一些方面，终止子寡核苷酸包括非天然核苷酸。在一些方面，终止子寡核苷酸在3'端具有阻止聚合酶延伸的化学功能化。在一些方面，化学功能化选自3-碳间臂、反向核苷酸和小沟结合物。
9、在一些方面，引物寡核苷酸是dna分子，终止子寡核苷酸是dna分子，靶标是dna分子，以及模板依赖性聚合酶是dna聚合酶。在一些方面，引物寡核苷酸是rna分子，终止子寡核苷酸是dna分子，靶标是dna分子，以及模板依赖性聚合酶是dna聚合酶。在一些方面，引物寡核苷酸是dna分子，终止子寡核苷酸是rna分子，靶标是rna分子，以及模板依赖性聚合酶是逆转录酶。在一些方面，引物寡核苷酸是dna分子，终止子寡核苷酸是dna分子，靶标是rna分子，以及模板依赖性聚合酶是逆转录酶。在一些方面，引物寡核苷酸是rna分子，终止子寡核苷酸是rna分子，靶标是rna分子，以及模板依赖性聚合酶是逆转录酶。在一些方面，引物寡核苷酸是rna分子，终止子寡核苷酸是dna分子，靶标是dna分子，以及模板依赖性聚合酶是rna聚合酶。
10、在一些方面，dna聚合酶选自由taq dna聚合酶、bst dna聚合酶或dna聚合酶i、hemo klen taq、phusion、q5、t7 dna聚合酶和kapa hifi组成的组。在一些方面，逆转录酶选自由莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶组成的组。
11、在一些方面，靶标是生物dna或rna分子。在一些方面，靶标是从细胞样品、生物流体或组织获得的。在一些方面，生物流体选自由血液、尿液、唾液、脑脊液、间质液和滑液组成的组。在一些方面，组织是活检组织或手术切除的组织。
12、在一些方面，靶标是通过rna样品的逆转录产生的互补dna分子。在一些方面，rna样品是生物rna样品。在一些方面，生物rna样品获自人类、动物、植物或环境样本。
13、在一些方面，靶标是通过作用于单链dna模板的dna聚合酶产生的扩增子dna分子。在一些方面，扩增子dna分子通过单细胞dna分子的多重置换扩增产生。
14、在一些方面，靶标是生物dna分子的物理、化学或酶促生成产物。在一些方面，靶标是片段化过程的产物。在一些方面中，所述片段化过程是超声处理或酶促片段化。
15、在一些方面，靶标是亚硫酸氢盐转化反应、apobec(“载脂蛋白b mrna编辑酶，催化多肽样”)反应、taps(tet辅助吡啶硼烷测序)反应或其它化学或酶促反应的产物，其中胞嘧啶核苷酸基于甲基化状态选择性地转化为尿嘧啶。
16、在一些方面，组合物包括多个终止子和/或多个引物。在一些方面，多个终止子中的每一个共享相同的第四序列，每个终止子可以共享相同的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种组合物，其包含：
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于通过聚合酶延伸形成靶核酸的嵌合扩增子，其中所述靶核酸从5'至3'包含结合区、匹配区和引发区。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含所述靶核酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述匹配区紧靠地位于所述结合区的3'。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述匹配区邻近所述结合区。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其进一步包含模板依赖性聚合酶。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其进一步包含聚合酶功能所需的试剂和缓冲剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与位于所述引发区的3'的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与紧靠地位于所述引发区的3'的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与位于所述引发
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸进一步包含位于所述第二序列与所述环序列之间的第五序列，以及位于所述环序列与所述第三序列之间的第六序列，其中所述第五序列与所述第六序列互补。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸在3'端具有至少3个核苷酸长度的与靶标不互补的子序列。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中在3'端的所述子序列形成至少一个发夹结构。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸包含非天然核苷酸。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸在3'端具有阻止聚合酶延伸的化学官能化。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述化学官能化选自由3-碳间隔物、反向核苷酸和小沟结合物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是DNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是DNA分子，并且模板依赖性聚合酶是DNA聚合酶。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是RNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是DNA分子，并且模板依赖性聚合酶是DNA聚合酶。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是DNA分子，所述终止子寡核苷酸是RNA分子，所述靶标是RNA分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是DNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是RNA分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
21.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是RNA分子，所述终止子寡核苷酸是RNA分子，所述靶标是RNA分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
22.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是RNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是DNA分子，并且模板依赖性聚合酶是RNA聚合酶。
23.根据权利要求17至18中任一项所述的组合物，其中所述DNA聚合酶选自由Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶或DNA聚合酶I、Hemo Klen Taq、Phusion、Q5、T7 DNA聚合酶和KAPAHiFi组成的组。
24.根据权利要求19至21中任一项所述的组合物，其中所述逆转录酶选自由莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶组成的组。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶是热稳定的。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶不是热稳定的。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述靶标是生物DNA或RNA分子。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述靶标获自细胞样品、生物流体或组织。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述生物流体选自由血液、尿液、唾液、脑脊液、间质液和滑液组成的组。
30.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组织是活检组织或手术切除的组织。
31.根据权利要...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种组合物，其包含：
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于通过聚合酶延伸形成靶核酸的嵌合扩增子，其中所述靶核酸从5'至3'包含结合区、匹配区和引发区。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含所述靶核酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述匹配区紧靠地位于所述结合区的3'。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述匹配区邻近所述结合区。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其进一步包含模板依赖性聚合酶。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其进一步包含聚合酶功能所需的试剂和缓冲剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与位于所述引发区的3'的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与紧靠地位于所述引发区的3'的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与位于所述引发区的3'的20个核苷酸区域内的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸进一步包含位于所述第二序列与所述环序列之间的第五序列，以及位于所述环序列与所述第三序列之间的第六序列，其中所述第五序列与所述第六序列互补。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸在3'端具有至少3个核苷酸长度的与靶标不互补的子序列。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中在3'端的所述子序列形成至少一个发夹结构。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸包含非天然核苷酸。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸在3'端具有阻止聚合酶延伸的化学官能化。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述化学官能化选自由3-碳间隔物、反向核苷酸和小沟结合物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是dna分子，所述终止子寡核苷酸是dna分子，所述靶标是dna分子，并且模板依赖性聚合酶是dna聚合酶。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是rna分子，所述终止子寡核苷酸是dna分子，所述靶标是dna分子，并且模板依赖性聚合酶是dna聚合酶。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是dna分子，所述终止子寡核苷酸是rna分子，所述靶标是rna分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是dna分子，所述终止子寡核苷酸是dna分子，所述靶标是rna分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
21.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是rna分子，所述终止子寡核苷酸是rna分子，所述靶标是rna分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
22.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是rna分子，所述终止子寡核苷酸是dna分子，所述靶标是dna分子，并且模板依赖性聚合酶是rna聚合酶。
23.根据权利要求17至18中任一项所述的组合物，其中所述dna聚合酶选自由taq dna聚合酶、bst dna聚合酶或dna聚合酶i、hemo klen taq、phusion、q5、t7 dna聚合酶和kapahifi组成的组。
24.根据权利要求19至21中任一项所述的组合物，其中所述逆转录酶选自由莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶组成的组。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶是热稳定的。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶不是热稳定的。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述靶标是生物dna或rna分子。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述靶标获自细胞样品、生物流体或组织。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述生物流体选自由血液、尿液、唾液、脑脊液、间质液和滑液组成的组。
30.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组织是活检组织或手术切除的组织。
31.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述靶标是通过rna样品的逆转录生成的互补dna分子。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述rna样品是生物rna样品。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述生物rna样品获自人类、动物、植物或环境样本。
34.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述靶标是通过作用于单链dna模板的dna聚合酶生成的扩增子dna分子。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述扩增子dna分子是通过单细胞dna分子的多重置换扩增生成的。
36.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述靶标是生物dna分子的物理、化学或酶促生成产物。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述靶标是片段化过程的产物。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述片段化过程是超声处理或酶促片段化。
39.根据权利要求36所述的组合物，其中所述靶标是亚硫酸氢盐转化反应、apobec(“载脂蛋白b mrna编辑酶、催化多肽样”)反应、taps(tet辅助的吡啶硼烷测序)反应或其他化学或酶促反应的产物，在所述其他化学或酶促反应中，胞嘧啶核苷酸基于甲基化状态选择性地转化为尿嘧啶。
40.根据权利要求1至29中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个终止子。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第四序列。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
43.根据权利要求41所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
44.根据权利要求41所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
45.根据权利要求40所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第四序列。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
47.根据权利要求45所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
48.根据权利要求45所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
49.根据权利要求40所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第四序列。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
51.根据权利要求49所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
52.根据权利要求49所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
53.根据权利要求40至52中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个引物。
54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含相同的3'子序列。
55.根据权利要求53所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含不同的3'子序列。
56.根据权利要求53所述的组合物，其中在所述多个引物中存在多个3'子序列。
57.根据权利要求1至39中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个引物。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含相同的3'子序列。
59.根据权利要求57所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含不同的3'子序列。
60.根据权利要求57所述的组合物，其中在所述多个引物中存在多个3'子序列。
61.根据权利要求57至60中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个终止子。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第四序列。
63.根据权利要求62所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
64.根据权利要求62所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
65.根据权利要求62所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
66.根据权利要求61所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第四序列。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
68.根据权利要求66所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
69.根据权利要求66所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
70.根据权利要求61所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第四序列。
71.根据权利要求70所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
72.根据权利要求70所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
73.根据权利要求70所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
74.一种用于通过聚合酶延伸形成靶核酸的嵌合扩增子的组合物，其中所述靶核酸从5'至3'包含结合区、匹配区和引发区，所述组合物包含终止子寡核苷酸，其中终止子从5'至3'包含：
75.根据权利要求74所述的组合物，其进一步包含所述靶核酸。
76.根据权利要求74至75中任一项所述的组合物，其中所述匹配区紧靠地位于所述结合区的3'。
77.根据权利要求74至75中任一项所述的组合物，其中所述匹配区邻近所述结合区。
78.根据权利要求74至77中任一项所述的组合物，其进一步包含引物寡核苷酸，其中包含至少15个核苷酸的引物的3'子序列与位于所述靶核酸上所述匹配区的3'的引发区序列互补。
79.根据权利要求74至77中任一项所述的组合物，其进一步包含模板依赖性聚合酶。
80.根据权利要求74至77中任一项所述的组合物，其进一步包含聚合酶功能所需的试剂和缓冲剂。
81.根据权利要求74至78中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与位于所述引发区的3'的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
82.根据权利要求74至78中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与紧靠地位于所述引发区的3'的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
83.根据权利要求74至78中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与位于所述引发区的3'的20个核苷酸区域内的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
84.根据权利要求74至83中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸进一步包含位于所述第二序列与所述环序列之间的第五序列，以及位于所述环序列与所述第三序列之间的第六序列，其中所述第五序列与所述第六序列互补。
85.根据权利要求74至84中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸在3'端具有至少3个核苷酸长度的与靶标不互补的子序列。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中在3'端的所述子序列形成至少一个发夹结构。
87.根据权利要求74至86中...
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