带可去除标记的核苷酸及制备方法和用于基因测序的方法技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种带可去除标记的核苷酸及其制备方法和用于基因测序的方法。基因测序的方法包括：Ａ．对于第一次延伸反应，在每个待测位点上利用带可去除标记的Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ四种核苷酸之一进行延伸反应，使得每个磁珠上有少量ＤＮＡ在当前位点上连接带可去除标记的核苷酸；Ｂ．对于第二次延伸反应，则连接普通的无标记的相同的核苷酸，从而达到对磁珠上１００％ＤＮＡ的延伸；Ｃ．通过饱和荧光标记的链酶亲和素或量子点对带可去除标记的ＤＮＡ进行染色；Ｄ．利用大规模、高像素的ＣＣＤ，读取大通量的碱基信号；Ｅ．去除步骤Ａ中核苷酸上的可去除标记，连同其转染信号，对另一种核苷酸重复前述步骤Ａ至Ｅ。本发明专利技术具有低成本、高通量的特点，并能测得较长的基因序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种带可去除标记的核苷酸及其制 备方法和用于基因测序的方法。
技术介绍
在传统的基因测序技术中，采用的是双脱氧链终止法(Sanger)。加入核苷酸到反 应体系中进行DNA合成反应，核苷酸上的碱基逐步结合到DNA待测模板的不同位点，在一次 合成结束时，由于每个碱基停止的位置不同，导致生成的各段DNA双链长短不一，则利用电 泳将其分开，然后标记ATCG，根据不同的停止位点测定各碱基。该测序技术成本较高，速度 慢，不能进行大规模平行测序。目前采用的一种测序方法是首先将模板与引物杂交；然后加入DNA聚合酶和修 饰过的核苷酸，该核苷酸连接有荧光标记物(Fluorophore)，DNA聚合反应时该荧光标记物 可使反应暂停；反应暂停时测定此处的碱基；最后去除该荧光标记物，使DNA聚合反应继 续。由上可知，该方法采用将荧光标记物堵住核苷酸的3端-OH的方式来达到暂停的目的， 但是在后续去除荧光标记物时必须切除-OH上的终止集团，每次反应之后在切除荧光标记 物时都无法达到100%的效率，这样会导致反应无法继续进行，就不能测得更长的基因序 列。另外一种连接测序方法，则测序长度较短，过程复杂，其应用有若干限制。这里，我们提出一种新的大规模、平行测序方法，可以解决现有高通量测序技术中 存在的若干问题，通过标记后信号放大，降低成本。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种带可去除标记的核苷酸，旨在解决现有高通量测 序技术中存在的测序长度较短、信号低、成本高等问题。为了实现专利技术目的，提供了一种新的基因测序方法，是利用带可去除标记的特定 核苷酸，通过标记/去标记的方式按顺序读出碱基序列，包括以下步骤A.对于第一次延 伸反应，在每个待测位点上利用所述带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸之一进行延伸 反应，使得每个磁珠上有少量DNA在当前位点上连接所述带可去除标记的核苷酸；B.对于 第二次延伸反应，则连接普通的无标记的相同的核苷酸，从而达到对磁珠上100% DNA的延 伸；C.通过饱和荧光标记的链酶亲和素或量子点对带可去除标记的DNA进行染色，从而达 到对磁珠上信号的足够放大；D.利用大规模、高像素的CCD，读取大通量的碱基信号；E.去 除步骤A中核苷酸上的可去除标记，连同其转染信号，对所述带可去除标记的A，T，C，G四 种核苷酸中的另外一种重复前述步骤A至E，并不断循环，以读取每个磁珠上DNA模板的碱 基序列。持续A，T，C，G四个碱基的，(A-E)的循环，直至所需的长度为止。本专利技术还提供了一种带可去除标记的核苷酸，结构通式如下权利要求一种基因测序方法，是利用带可去除标记的特定核苷酸，通过标记/去标记的方式按顺序读出碱基序列，其特征在于，包括以下步骤A.对于第一次延伸反应，在每个待测位点上利用所述带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸之一进行延伸反应，使得每个磁珠上有少量DNA在当前位点上连接所述带可去除标记的核苷酸；B.对于第二次延伸反应，则连接普通的无标记的相同的核苷酸，从而达到对磁珠上100％DNA的延伸；C.通过饱和荧光标记的链酶亲和素或量子点对带可去除标记的DNA进行染色达到对标记信号的放大；D.利用大规模、高像素的CCD，读取大通量的碱基信号；E.去除步骤A中核苷酸上的可去除标记，连同其转染信号，对所述带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸中的另外一种重复前述步骤A至E，并循环。2.根据权利要求1所述的基因测序方法，其特征在于，在所述步骤A之前还包括以下步 骤将一通用引物杂交到所有磁珠上的所有DNA模板。3.根据权利要求1所述的基因测序方法，其特征在于，所述方法包括步骤A中，每次延伸占据少量DNA模板，并在每次CCD读取延伸反应后将标记物彻底去 除；步骤B中，则连接普通的无标记核苷酸；前述步骤A、B重复多次，其有效读取长度由可接受的最终信噪比决定。4.根据权利要求3所述的基因测序方法，其特征在于，所述对标记物进行去除的方法 包括若携带可去除标记的核苷酸中的可切除位点为双硫键，则通过DTT、β-巯基乙醇或 TCEP-盐酸切除修饰物；若携带可去除标记的核苷酸中的可切除位点为吡喃醇结构，则通过酸性试剂进行切除。5.一种带可去除标记的核苷酸，结构通式如下6.根据权利要求5所述的带可去除标记的核苷酸，其特征在于，所述可切除位点-R的 结构由双硫键构成，即-s-s-，可通过还原剂打开。7.根据权利要求5所述的带可去除标记的核苷酸，其特征在于，所述可切除位点-R为 吡喃醇结构，即8.一种带可去除标记的核苷酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括A.将氨基修饰物结合到核苷酸中的碱基上，生成携带氨基末端的核苷酸；B.对标记物进行化学修饰，使其包含一可切除位点，并对标记物进行醛基修饰；C.将步骤A中生成的携带氨基末端的核苷酸，与步骤B中生成的携带醛基末端的标记 物进行反应，以酯键结合，生成所述带可去除标记的核苷酸。9.根据权利要求8所述的带可去除标记的核苷酸的制备方法，其特征在于，所述可切 除位点的生成过程包括对标记物进行化学修饰，生成双硫键-S-S-作为可切除位点。10.根据权利要求8所述的带可去除标记的核苷酸的制备方法，其特征在于，所述可切 除位点的生成过程包括对标记物进行化学修饰，生成吡喃醇结构作为可切除位点，即全文摘要本专利技术涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种带可去除标记的核苷酸及其制备方法和用于基因测序的方法。基因测序的方法包括A.对于第一次延伸反应，在每个待测位点上利用带可去除标记的A，T，C，G四种核苷酸之一进行延伸反应，使得每个磁珠上有少量DNA在当前位点上连接带可去除标记的核苷酸；B.对于第二次延伸反应，则连接普通的无标记的相同的核苷酸，从而达到对磁珠上100％DNA的延伸；C.通过饱和荧光标记的链酶亲和素或量子点对带可去除标记的DNA进行染色；D.利用大规模、高像素的CCD，读取大通量的碱基信号；E.去除步骤A中核苷酸上的可去除标记，连同其转染信号，对另一种核苷酸重复前述步骤A至E。本专利技术具有低成本、高通量的特点，并能测得较长的基因序列。文档编号C07H19/20GK101935702SQ20101025145公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日专利技术者盛司潼, 邵志峰, 金虹, 龚兵 申请人:深圳华因康基因科技有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因测序方法，是利用带可去除标记的特定核苷酸，通过标记／去标记的方式按顺序读出碱基序列，其特征在于，包括以下步骤：　　Ａ．对于第一次延伸反应，在每个待测位点上利用所述带可去除标记的Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ四种核苷酸之一进行延伸反应，使得每个磁珠上有少量ＤＮＡ在当前位点上连接所述带可去除标记的核苷酸；　　Ｂ．对于第二次延伸反应，则连接普通的无标记的相同的核苷酸，从而达到对磁珠上１００％ＤＮＡ的延伸；　　Ｃ．通过饱和荧光标记的链酶亲和素或量子点对带可去除标记的ＤＮＡ进行染色达到对标记信号的放大；　　Ｄ．利用大规模、高像素的ＣＣＤ，读取大通量的碱基信号；　　Ｅ．去除步骤Ａ中核苷酸上的可去除标记，连同其转染信号，对所述带可去除标记的Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ四种核苷酸中的另外一种重复前述步骤Ａ至Ｅ，并循环。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，邵志峰，龚兵，金虹，
申请(专利权)人：深圳华因康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]