传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法技术

本发明专利技术公开了传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法，特点是包括以下步骤：（１）设计１条锁式探针和１对针对锁式探针连接序列的通用引物；（２）配制锁式探针连接反应体系，进行连接反应；（３）配制ＨＲＣＡ反应体系，进行ＨＲＣＡ扩增反应，最后对ＨＲＣＡ反应产物进行检测，优点是具有比现有技术的ＰＣＲ检测传染性脾肾坏死病毒的方法具有更高的灵敏度、特异性和便捷性，并且可以在实际生产中现场应用，有利于检测和控制水产动物养殖中传染性脾肾坏死病毒的传染和交叉。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法，其特征在于包括以下步骤：　　（１）锁式探针的合成：从ＩＳＫＮＶ　ＤＰＯＬ基因序列中分别选取２０个碱基作为锁式探针５′端和３′端的特异识别区，５′末端碱基和３′末端碱基在ＩＳＫＮＶ　ＤＰＯＬ基因序列上连续，从质粒载体ｐＮＡＫ１中选取３７７９－３６９２ｎｔ段的基因序列，将该基因序列中与５′末端碱基和３′末端碱基互补的碱基替换后形成的核苷酸序列作为锁式探针的连接段部分，然后进行锁式探针的合成，再对合成的锁式探针进行５’端磷酸化，所述的锁式探针的核苷酸序列如下：　　５’－ＧＡＧＴＣＧＡＧＣＴ　ＴＧＴＧＡＴＣＣＡＴ　ｔｇｇａｃｔｇｃｔｇ　ａａｔｃｃｇｔｔａｇ　ｃｃａｇｃａｇｃｃｇ　ｃｃｔｃｇａｃｇａａｔｔｔｃｔｇｃｃａｔ　ｔｃａｔｃｃｃｃｔｔ　ａｔｔａｔｃａｃｔｔ　ａｔｔｃａｇｇｃｇｔ　ａｇｃａｃｃａｇ　ＣＣＡＣＡＴＡＧＴＣＣＡＧＧＣＴＧＴＡＣ－３’；１２８　　（２）根据锁式探针的连接段序列设计一对通用引物：　　ＣＦ１：５’－ＣＴＧＧＴＧＣＴＡＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＧＴＧＡ－３’，　２４　　ＣＦ２：５’－ＧＣＴＧＡＡＴＣＣＧＴＴＡＧＣＣＡＧＣＡＧ－３’；　２１　　（３）配制连接反应体系：连接反应体系的终浓度分别为：锁式探针１ｐＭ－１μＭ，１０×Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　１μｌ，样品模板２μｌ，加双蒸水至反应总体积１０μＬ；　　（４）锁式探针的连接反应：将上述连接反应体系在９４－１００℃下变性３－５ｍｉｎ后，冰浴３－５ｍｉｎ，再加１Ｕ／μｌ　Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ，在３７℃条件下，反应１０－６０ｍｉｎ；　　（５）配制ＨＲＣＡ反应体系：反应体系各组分终浓度分别为：ｄＮＴＰｓ　０．４ｍＭ、ＣＦ１０．４μＭ、ＣＦ２　０．４μＭ、ｐＨ　８．８的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　２０ｍＭ、ＫＣｌ　１０ｍＭ、ＭｇＳＯ↓［４］　６．５ｍＭ、（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］　１０ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ－１００和８Ｕ　Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶大片段，连接产物２μｌ，加双蒸水至反应体系总体积为２５μｌ；　　（６）ＨＲＣＡ反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为６１－６５℃，扩增反应时间为１０－６０ｍｉｎ；　　（７）ＨＲＣＡ反应产物的检测：将ＨＲＣＡ扩增反应产物通过琼脂糖凝胶电泳观察扩增条带，呈阶梯状分布则表示该样品的ＩＳＫＮＶ的检测结果为阳性，反之无扩增条带或扩增条带为非...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈炯，史雨红，孔诚将，陆新江，李登峰，李明云，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：97[中国|宁波]