【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及眼科疾病防治，更具体地说，涉及一种利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂及制备方法。
技术介绍
1、血管生成即新血管从原有血管中萌发的过程，与多种人类疾病相关，包括肿瘤生长、癌症转移、增殖性糖尿病视网膜病变(pdr)、早产儿视网膜病变(rop)和新生血管性年龄相关性黄斑变性(namd)等。
2、血管内皮生长因子(vegf)/vegf受体(vegfr)2的信号通路对血管生成至关重要(holmes等人，2007)，因此许多拮抗剂，如雷尼单抗、贝伐单抗、阿非利西普、索拉非尼和舒尼替尼，阻断了这一通路，已被开发用于治疗血管生成相关的人类疾病。尽管如此，仍有无数患者对这些疗法产生耐药性。因此，迫切需要新的治疗方法来治疗血管生成相关疾病，包括在工作年龄人群中占据获得性失明最多的pdr。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，还提供了一种利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的抑制药剂。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、构造一种利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其中，所述药剂携带有靶向基因组vegfr2的ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr和ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr。
4、本专利技术所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其中，所述药剂
5、本专利技术所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其中，所述ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr用于表达由u6启动子驱动的结构化rna序列的epegrna和由ef1α核心启动子驱动的密码子优化rt的spcas9n融合蛋白。
6、本专利技术所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其中，所述ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr用于表达切取sgrna和显性负性mlh1。
7、一种利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其中，实现方法如下：
8、构建携带u6-epgrna和spcas9n融合蛋白序列的ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr；
9、构建携带u6-sgrna和ef-1α-mlhdn的ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr。
10、本专利技术所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其中，药剂通过将携带突变d64v的整合酶缺陷包装载体、表达慢病毒包膜的载体，以及ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr或ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr的质粒转染到293t细胞中制备整合酶缺陷慢病毒来携带ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr或ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr。
11、本专利技术所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其中，所述ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr由lent-crispr v2通过将spcas9替换为spcas9n-ert，然后插入合成的epegrna衍生制成。
12、本专利技术所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其中，所述pltr-u6-sgrna-ef-1-mlh1dn-ltr由lenti-crispr v2用mlh1dn替换spcas9衍生，然后通过bsmb1插入ngrna制成。
13、本专利技术所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其中，所述ngrna制作采用方法：退火顶部寡核苷酸5'caccg-tcatccaagggcaattcatc和底部寡核苷酸5'-aaac-20nt-c-3'，20nt为互补的顶部寡核苷酸序列。
14、本专利技术所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其中，所述药剂制备方法还包括步骤：
15、ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr或ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr、慢病毒信封质粒vsv-g和慢病毒包装质粒pspax2或integrase-deficient慢病毒包装转染混合；
16、将转染混合物在室温下孵育，转移到细胞培养皿中培养，收集慢病毒，将含病毒培养基离心，将病毒颗粒悬浮在无菌tne缓冲液中。
17、本专利技术的有益效果在于：本申请的药剂，通过ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr和ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr对vegfr2基因位点编辑，使得视网膜vegfr2 t17967a更早的突变产生终止密码子(tag,k796stop)和dn-vegfr2，从而阻断了视网膜vegfr2的表达和活性，阻断oir小鼠模型的视网膜异常血管生成，达到预防病理性视网膜血管生成目的。
18、附图说明
19、为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图：
20、图1a是递送pe6的双重整合酶缺陷慢病毒示意图；
21、图1b是用pe6生成突变型vegfr2(k796stop)的示意图；
22、图1c是完全和显性负性vegfr2示意图；
23、图2a是小鼠血管内皮细胞(mvecs)的澄清裂解物的蛋白质印迹分析示意图；
24、图2b是蛋白质印迹条带强度定量示意图；
25、图3a是sanger dna测序分析示意图；
26、图3b是mvecs基因组位点pcr产物的二代测序(ngs)分析示意图；
27、图3c是用所示抗体对转导的mvecs裂解物进行蛋白质印迹分析示意图；
28、图4a是对小鼠血管内皮细胞的裂解物进行蛋白质印迹分析示意图；
29、图4b是3个代表性实验的western blot条带强度数据示意图；
30、图5a是建本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其特征在于，所述药剂携带有靶向基因组VEGFR2的LTR-U6-epegRNA-EF1α-nSpCas9-RT-LTR和LTR-U6-nicking sgRNA-EF1α-MLH1dn-LTR。
2.根据权利要求1所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其特征在于，所述药剂通过将携带突变D64V的整合酶缺陷包装载体、表达慢病毒包膜的载体，以及LTR-U6-epegRNA-EF1α-nSpCas9-RT-LTR或LTR-U6-nicking sgRNA-EF1α-MLH1dn-LTR的质粒转染到293T细胞中制备整合酶缺陷慢病毒来携带LTR-U6-epegRNA-EF1α-nSpCas9-RT-LTR或LTR-U6-nicking sgRNA-EF1α-MLH1dn-LTR。
3.根据权利要求1所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其特征在于，所述LTR-U6-epegRNA-EF1α-nSpCas9-RT-LTR用于表达由U6启动子驱动的结构化RNA序列的epegRNA和由EF1α核心启动
4.根据权利要求1所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其特征在于，所述LTR-U6-nicking sgRNA-EF1α-MLH1dn-LTR用于表达切取sgRNA和显性负性MLH1。
5.一种利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其特征在于，实现方法如下：
6.根据权利要求5所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其特征在于，药剂通过将携带突变D64V的整合酶缺陷包装载体、表达慢病毒包膜的载体，以及LTR-U6-epegRNA-EF1α-nSpCas9-RT-LTR或LTR-U6-nicking sgRNA-EF1α-MLH1dn-LTR的质粒转染到293T细胞中制备整合酶缺陷慢病毒来携带LTR-U6-epegRNA-EF1α-nSpCas9-RT-LTR或LTR-U6-nicking sgRNA-EF1α-MLH1dn-LTR。
7.根据权利要求5所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其特征在于，所述LTR-U6-epegRNA-EF1α-nSpCas9-RT-LTR由lent-crispr v2通过将SpCas9替换为SpCas9n-ert，然后插入合成的epegRNA衍生制成。
8.根据权利要求5所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其特征在于，所述pLTR-U6-sgRNA-EF-1-MLH1dn-LTR由lenti-crispr v2用MLH1dn替换SpCas9衍生，然后通过BsmB1插入ngRNA制成。
9.根据权利要求5所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其特征在于，所述ngRNA制作采用方法：退火顶部寡核苷酸5'CACCG-TCATCCAAGGGCAATTCATC和底部寡核苷酸5'-aaac-20nt-c-3'，20nt为互补的顶部寡核苷酸序列。
10.根据权利要求4所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其特征在于，所述药剂制备方法还包括步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其特征在于，所述药剂携带有靶向基因组vegfr2的ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr和ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr。
2.根据权利要求1所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其特征在于，所述药剂通过将携带突变d64v的整合酶缺陷包装载体、表达慢病毒包膜的载体，以及ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr或ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr的质粒转染到293t细胞中制备整合酶缺陷慢病毒来携带ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr或ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr。
3.根据权利要求1所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其特征在于，所述ltr-u6-epegrna-ef1α-nspcas9-rt-ltr用于表达由u6启动子驱动的结构化rna序列的epegrna和由ef1α核心启动子驱动的密码子优化rt的spcas9n融合蛋白。
4.根据权利要求1所述的利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂，其特征在于，所述ltr-u6-nicking sgrna-ef1α-mlh1dn-ltr用于表达切取sgrna和显性负性mlh1。
5.一种利用增强的先导编辑阻断异常血管生成的药剂制备方法，其特征在于，实现方法如下：
6.根据权利要求5所述的利用增强的先导编辑阻断异常血...
【专利技术属性】
技术研发人员：雷和田，张国明，祁慧，吴文一，董利军，
申请(专利权)人：深圳市眼科医院深圳市眼病防治研究所，
类型：发明
国别省市：
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