【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于及生物工程，特别涉及一种鸡肠上皮细胞的培养方法。
技术介绍
1、鸡肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,iec)是营养物质消化和吸收的主要场所，通过细胞连接紧密排列，并通过产生糖蛋白和防御素有效抵御外部环境中细菌病毒的入侵。目前，部分学者已经成功地建立了鸡iec的分离和培养方法，但是原代细胞的寿命很短，通常在体外为5-6天就脱落死亡，最长为12d，稳定的细胞培养方式有待进一步研究。
2、滋养细胞是有丝分裂过程被抑制的单层细胞，在培养体系中起分泌生长因子和提供物理支持的作用，常应用于干细胞及上皮细胞的培养。目前，常用的滋养细胞有3t3细胞，小鼠胚胎成纤维细胞和人真皮成纤维细胞，来源于鸡种属的滋养细胞存在空缺。不同于多种哺乳动物已有稳定的肠上皮细胞系，鸡肠上皮细胞体外模型的缺乏限制了家禽营养吸收和肠道疾病的研究进展。
3、紫锥菊作为一种天然的草本植物，紫锥菊当中含有的菊苣酸，咖啡酸类衍生物和多糖等物质，能增强动物机体的免疫力，具有抗氧化，抗病毒和抗菌等的作用，作为天然饲料添加剂在畜牧业中有巨大的应用前景，但目前仅因其具有免疫调节和抗炎作用在人医上被广泛应用，然而，在兽医领域却鲜有报道。
技术实现思路
1、基于此，为解决现有技术中存在的至少一种技术问题，本专利技术提供一种鸡肠上胞细胞的培养方法。
2、本专利技术提供的鸡肠上皮细胞的培养方法，包括如下步骤：
3、1)采集15-20胚龄鸡胚的肠组织，利
4、2)原代鸡肠道成纤维细胞经过传代培养，经过丝裂霉素c处理获得滋养细胞；
5、3)对步骤2)获得的滋养细胞与分离得到的鸡肠上皮细胞进行共培养，共培养培养基中含有紫锥菊提取物。
6、基于鸡是早熟的动物，肠道在胚胎后期完全成熟，因此选用为15～20胚龄的鸡胚进行肠道上皮细胞分离。现有的原代细胞主要分离方式为酶消化法和组织贴壁法，后者虽然有效的避免了酶消化引起的细胞损伤，但培养时间较长，细胞获得量较少，不适用于迁移能力较差的上皮细胞培养，因此目前较多的采用噬热菌蛋白酶和胶原酶，而本试验选用的iv胶原酶，减少因细胞膜的损伤而引起的细胞贴壁能力下降。进而结合采用低成本的丝裂霉素c处理制备滋养细胞，为鸡肠上皮细胞的培养提供新的工具细胞株，同时采用含有紫锥菊提取物的培养基对滋养细胞和鸡肠上皮细胞进行共培养，促进受损的鸡iec增殖；从而建立一种新的鸡肠上皮细胞的培养方法。
7、优选地，所述步骤1)中，iv型胶原酶消化液浓度为0.5-2mg/ml。
8、优选地，所述步骤1)和2)中，重悬、培养和传代培养用到的培养基均为含有10％fbs、1％谷氨酰胺和1％双抗的完全培养基。
9、优选地，所述步骤2)中，丝裂霉素c浓度为8-13μg/ml。
10、优选地，所述步骤3)中，共培养培养基中含有31.25-2000μg/ml的紫锥菊提取物。
11、优选地，所述紫锥菊提取物的制备工艺包括以下步骤：
12、(a)获取40～60目紫锥菊全草粗粉；
13、(b)将紫锥菊全草粗粉与10～30倍量的40％～90％乙醇混合，浸泡20-40分钟后，采用40℃～70℃乙醇回流提取1～3次，每次1～3小时；随后进行抽滤，并将滤液合并；
14、(c)采用大孔树脂柱吸附滤液，然后使用去离子水洗涤至流出液无色，随后采用30％～70％乙醇溶液进行洗脱；
15、(d)合并大孔树脂纯化后的洗脱液，浓缩，回收乙醇；接着，使用盐酸和5％naoh调节溶液的ph值为3，进行3～4次醋酸乙酯萃取；
16、(e)收集萃取液，在55～65℃下真空蒸干，得到紫锥菊提取物粉末。
17、优选地，所述步骤3)中，共培养培养基为完全培养基，其中还含有10％ fbs、1％谷氨酰胺、10μmol/ml y-27632和1％双抗。
18、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
19、本专利技术首先通过iv型胶原酶消化法得到鸡肠道成纤维细胞，并采用丝裂霉素c将其制备成滋养细胞与分离的鸡iec共培养。结果显示分离的鸡iec，与滋养细胞共培养增殖能力良好；此外31.25-2000μg/ml的紫锥菊提取物能有效促进受损的鸡iec增殖。结果表明鸡肠道成纤维细胞可以作为滋养细胞培养鸡iec，且紫锥菊提取物对其增殖有促进作用，为iec的体外培养提供新的途径。
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1.一种鸡肠上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)中，IV型胶原酶消化液浓度为0.5-2mg/mL。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)和2)中，重悬、培养和传代培养用到的培养基均为含有10％FBS、1％谷氨酰胺和1％双抗的完全培养基。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，丝裂霉素C浓度为8-13μg/ml。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)中，共培养培养基中含有31.25-2000μg/mL的紫锥菊提取物。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)中，共培养培养基中含有500μg/mL的紫锥菊提取物。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述紫锥菊提取物的制备工艺包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)中，共培养培养基为完全培养基，其中还含有10％FBS、1％谷氨酰胺、10μmol/mL Y-
...【技术特征摘要】
1.一种鸡肠上皮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)中，iv型胶原酶消化液浓度为0.5-2mg/ml。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)和2)中，重悬、培养和传代培养用到的培养基均为含有10％fbs、1％谷氨酰胺和1％双抗的完全培养基。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，丝裂霉素c浓度为8-13μg/ml。
5.根据权利要求1所述的培养方...
【专利技术属性】
技术研发人员：李美娣，吉艺宽，董芳远，蔡孟楷，贾聪俊，
申请(专利权)人：广东梅州职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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