【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种生产有机酸的工程菌群及其构建方法和应用。
技术介绍
1、丙氨酸作为氨基酸的一种，是构成生命基础物质蛋白质的基本单元，参与糖代谢和氨基酸循环等生命过程。丙氨酸具备α-丙氨酸和β-丙氨酸两种同分异构体。α-丙氨酸存在l-丙氨酸和d-丙氨酸两种立体镜像。dl-丙氨酸为α-丙氨酸的外消旋体。l-丙氨酸常用于食品、制药和材料应用。它不仅是一种重要的甜味剂和调味料，也是新型绿色螯合剂的原料甲基甘氨酸二乙酸。在医学领域，l-丙氨酸是重要的胰高血糖素刺激剂。因此它在糖尿病的研究和治疗中发挥着重要作用。丙烯酸是一种用途广泛的化工产品。它是最简单的不饱和羧酸，由直接连接到羧酸末端的乙烯基组成。丙烯酸作为一种商用的化工中间体，可以用于高分子材料的生产加工。作为原材料生产的sap材料市场广阔，比如聚丙烯酸，是超吸收尿布的重要组成成分。传统的丙烯酸的工业制备通常由丙烯的氧化来实现。但化石来源的化学品通常会受到原料价格波动、不稳定的供应链等因素影响，亟需寻找到更优的、能源和资本所需较少的可替代的方案。生物基丙烯酸是传统石化丙烯酸的生物基替代品。它由可再生原料(例如葡萄糖或其他糖)和淀粉基材料(主要来自玉米)生产。生物基丙烯酸可以减少对化石燃料和不可再生资源的依赖，减轻碳足迹，满足长期的可持续发展，逐渐成为前景广阔的方向。
2、全球市场中亚太地区生物基丙烯酸市场表现最有活力。19年lg化学与adm(阿彻丹尼尔斯米德兰)公司合作联合开发生产生物基丙烯酸。化工巨头阿科玛(arkema，法国)2022年推出系列丙烯酸单体和特
3、国内丙氨酸市场以华恒生物为龙头，2012年华恒生物实现了全球首次厌氧发酵l-丙氨酸万吨级商业化生产。目前发酵法年产能2万吨，酶法年产能0.2万吨。厌氧发酵l-丙氨酸技术已经为企业新增28.8亿，其l-丙氨酸实现全球占有率60％以上。发酵法和酶法分别售价1.6万/吨和2万/吨，分别实现毛利率46％和10％～25％。其它国内主要生产企业有丰原石化和烟台恒源，国外生产企业主要有武藏野。
4、传统l-丙氨酸工业生产以石油基产物为原料经l-天冬氨酸酶法获得。生产成本居高不下(因天冬氨酸价格昂贵)，环保压力大等因素限制了l-丙氨酸的下游应用。而若考虑生物法合成，目前自然菌生产丙氨酸或者其它目标产物产量较低。以原料丰富的葡萄糖或者甘油为底物的生物发酵法因路径丰富近年来收到越来越多的学者青睐。可以用基因工程调控目的产物的表达来提高生物发酵的产量。
5、因此，亟需提供一种生产有机酸的工程菌群及其构建方法，实现天冬氨酸、l-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸和丙烯酸的可控生产。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种生产有机酸的工程菌群及其构建方法和应用，通过增加转化途径中关键酶的表达增加前体物质的供应量和敲除支路基因抑制碳流分流，实现了天冬氨酸、l-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸和丙烯酸的可控生产。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种工程菌群的构建方法，所述构建方法包括：
4、敲除受体菌的d-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因；导入丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因。
5、本专利技术中通过增加转化途径中关键酶的表达增加前体物质的供应量和敲除支路基因抑制碳流分流，实现了天冬氨酸、l-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸和丙烯酸的可控生产。
6、优选地，所述导入丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因之后还包括：导入天冬氨酸β脱羧酶基因。
7、优选地，所述构建方法在导入天冬氨酸β脱羧酶基因之后还包括导入天冬氨酸α脱羧酶基因。
8、优选地，所述构建方法在导入天冬氨酸α脱羧酶基因之后还包括导入β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶基因。
9、优选地，所述构建方法在导入β-丙氨-丙酮酸氨基转移酶基因之后还包括导入3-羟基酸脱氢酶基因。
10、优选地，所述受体菌包括含有所述d-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的细菌或真菌。
11、优选地，所述受体菌包括大肠杆菌。
12、优选地，所述敲除受体菌的d-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因通过向所述受体菌中分别导入含有d-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的上下游同源臂的dna片段和敲除元件实现；所述敲除元件包括frt+抗性基因氨苄+frt。
13、优选地，所述含有d-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因上下游同源臂的dna片段的核酸序列包括如seq id no.1-seq id no.12所示的序列。
14、d-乳酸脱氢酶基因idha上、下游同源臂基因序列seq id no.1-seq id no.4：
15、seq id no.1：
16、uf:5’-atcggcattgcccagaaggggccgtttatgttgccagacagcgctactga-3’。
17、seq id no.2：
18、df:5’-tcagtagcgctgtctggcaacataaacggccccttctgggcaatgccgat-3’。
19、seq id no.3：
20、ur:5’-aatgctctcctgataatgttaaacttttttagtaaatcatctgctcgaat-3’。
21、seq id no.4：
22、dr:5’-attcgagcagatgatttactaaaaaagtttaacattatcaggagagcatt-3’。
23、醛醇脱氢酶基因adhe上、下游同源臂seq id no.5-8：
24、seq id no.5：
25、uf:5’-atcggcattgcccagaaggggccgtttatgttgccagacagcgctactga-3’。
26、seq id no.6：
27、df:5’-tcagtagcgctgtctggcaacataaacggccccttctgggcaatgccgat-3’。
28、seq id no.7：
29、ur:5’-aatgctctcctgataatgttaaacttttttagtaaatcatctgctcgaat-3’。
30、seq id no.8：...
【技术保护点】
1.一种工程菌群的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法在导入丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因之后还包括：导入天冬氨酸β脱羧酶基因；
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述受体菌包括含有所述D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的细菌或真菌。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述敲除受体菌的D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因通过向所述受体菌中分别导入含有D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的上下游同源臂的DNA片段和敲除元件实现；所述敲除元件包括FRT+抗性基因氨苄+FRT。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述含有D-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因上下游同源臂的DNA片段的核酸序列包括如SEQ ID No.1-SEQ IDNo.12所示的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因的来源包
7.根据权利要求1-6中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶基因的核酸序列包括如SEQ ID No.13所示的序列；
8.一种基因工程菌群，其特征在于，所述基因工程菌由权利要求1-7中任一项所述的构建方法构建得到。
9.权利要求8所述的基因工程菌群在生产有机酸或制备有机酸产品中的应用；所述有机酸包括天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸或丙烯酸中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种生产有机酸的方法，其特征在于，所述方法包括以葡萄糖为碳源，利用权利要求8所述的基因工程菌群进行生物转化，制备有机酸；所述有机酸包括天冬氨酸、L-丙氨酸、β-丙氨酸、3-羟基丙酸或丙烯酸中的任意一种或至少两种的组合。
...【技术特征摘要】
1.一种工程菌群的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法在导入丙酮酸羧化酶基因和天冬氨酸转氨酶基因之后还包括：导入天冬氨酸β脱羧酶基因；
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述受体菌包括含有所述d-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的细菌或真菌。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述敲除受体菌的d-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因通过向所述受体菌中分别导入含有d-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因的上下游同源臂的dna片段和敲除元件实现；所述敲除元件包括frt+抗性基因氨苄+frt。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述含有d-乳酸脱氢酶基因、醛醇脱氢酶基因和乙酸激酶基因上下游同源臂的dna片段的核酸序列包括如seq id no.1-se...
【专利技术属性】
技术研发人员：温燕丽，陈思宇，
申请(专利权)人：上海沐深新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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