【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微藻外泌体培养和分离，尤其涉及一种微藻外泌体及其制备方法。
技术介绍
1、外泌体(exosome)是细胞向胞外分泌的囊泡类小体，直径约为30-150纳米之间，可存在于细胞培养上清液、血浆、血清、唾液、尿液以及其它生物体液中。外泌体具有异质性，即使是同一种细胞分泌的外泌体都有可能具有很大功能区别。外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白、mirna、lncrna、circrna、mrna以及其降解片段，参与细胞活动的重要调控；在肿瘤转移、免疫调控机制、疾病发生发展、阿兹海默症和免疫疾病等疑难杂症的治疗方面崭露头角，有望成为多种疾病的早期诊断标志物。
2、微藻是指那些在显微镜下才能辨别其形态的微小的藻类群体，主要可分属于蓝藻门、绿藻门、金藻门和红藻门。微藻生产力高、用海水作为天然培养基，且其生长速度快，营养丰富，在水产养殖、保健等诸多领域具有广泛的用途。目前，外泌体的分离方法主要有：差速离心、密度梯度离心、体积排阻色谱法、过滤法、聚合物沉淀法、免疫分离、隔离筛选法等。现有技术仅有一些利用超速离心法从微拟球藻中提取获得微藻类外泌体的报道，但未见有关于从微藻培养液中分离得到微藻外泌体的报道。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种微藻外泌体及其制备方法。本专利技术首次采用特定专用培养基的富集方法和特定分离技术得到比传统方法浓度更高的微藻外泌体，符合gmp标准的微藻外泌体的工业化标准；同时，本专利技术提供的微藻外泌体制备方法和分离技术具有养殖培养条件和分
2、第一方面，本专利技术提供了一种微藻外泌体的制备方法，所述微藻外泌体的制备方法包括以下步骤：
3、s1、育种培养阶段：将藻种接种于基础培养基进行育种培养，得到第一培养液；
4、s2、一级扩增培养阶段：将所述第一培养液继续于基础培养基中进行一级扩增培养，得到第二培养液；
5、s3、二级胁迫扩增培养阶段：将所述第二培养液转移至第一专用培养基或第二专用培养基中进行二级胁迫扩增培养，得到第三培养液；
6、s4、分离阶段：将所述第三培养液进行离心分离，得到上清液；后将所述上清液进行切向流过滤分离，得到所述微藻外泌体；
7、其中，所述第一专用培养基中含有：nacl 1.950～2.050g/l、fecl3 0.450～0.550g/l和nahco3 0.150～0.250g/l；或，
8、所述第二专用培养基中含有：富马酸钠0.450～0.550g/l、葡萄糖4.50～5.50g/l和nahco30.150～0.250g/l。
9、进一步地，所述微藻种类包括所有真核类微藻。
10、进一步地，当微藻种类为雨生红球藻时，所述二级胁迫扩增培养阶段包括以下过程：
11、将所述第二培养液转移至第一专用培养基中进行二级胁迫扩增培养，培养时间为7-10天，培养温度为28～32℃，光照强度为9000～11000l/min，得到第三培养液。
12、进一步地，所述第一专用培养基中含有：nacl 2.000g/l、fecl3 0.500g/l和nahco30.200g/l。
13、进一步地，当微藻种类为三角褐指藻时，所述二级胁迫扩增培养阶段包括以下过程：
14、将所述第二培养液转移至第二专用培养基中进行二级胁迫扩增培养，培养时间为7-10天，培养温度为28～32℃，光照强度为1000～5000l/min，得到第三培养液。
15、进一步地，所述第二专用培养基中含有：富马酸钠0.500g/l、葡萄糖5.00g/l和nahco30.200g/l。
16、进一步地，所述育种培养阶段的工作参数包括：培养时间为7～10d，培养温度为20～25℃，ph为6.5～7.5，光照强度为500～3000lux；所述二级胁迫扩增培养阶段的工作参数包括：培养时间为7～10d，培养温度为20～25℃，ph为6.5～7.5，光照强度为1000～4000lux。
17、进一步地，将所述第三培养液进行离心分离，得到上清液；后将所述上清液进行切向流过滤分离，得到所述微藻外泌体的步骤包括以下过程：
18、于离心力为7500～8500g、温度为18～25℃和进货流量为1.5～2.5m3/h条件下，将所述第三培养液进行连续性离心分离，得到上清液；
19、将所述上清液经膜过滤器进行深层过滤，后采用300～1000kd膜包进行切向流过滤，得到透过液；
20、采用100～300kd膜包对所述透过液进行切向流浓缩，得到所述外泌体。
21、第二方面，本专利技术提供了一种微藻外泌体，所述微藻外泌体是采用第一方面任一项所述的制备方法制得。
22、进一步地，当微藻种类为雨生红球藻时，所述微藻外泌体的平均粒径为30～200nm，浓度≥1.0×1010particles/ml；当微藻种类为三角褐指藻时，所述微藻外泌体的平均粒径为30～200nm，浓度≥1.0×1010particles/ml。
23、本专利技术实施例提供的上述技术方案与现有技术相比至少具有如下优点：
24、本专利技术实施例提供了一种微藻外泌体及其制备方法，本专利技术首次采用特定专用培养基的富集方法和特定分离技术得到比传统方法浓度更高的微藻外泌体；同时，本专利技术提供的微藻外泌体制备方法和分离技术具有养殖培养条件和分离技术的全程自动化控制，可以形成大规模化工业生产，具有广泛地工业化应用前景。具体来说：
25、1)相较于采用现有传统的微藻培养基，本专利技术通过采用第一专用培养基或第二专用培养基中进行微藻的二级胁迫扩增培养，不仅能够提高微藻外泌体的富集作用，其富集程度可以高出采用现有传统微藻培养基的100倍；而且能够促进形成平均粒径更小的微藻外泌体，便于后续的分离提取。
26、2)本专利技术通过对微藻培养所得上清液采用特定的切向流过滤分离技术，首次在微藻中成功地分离出了外泌体。而且进一步证实了无论在采用现有传统微藻培养基的传统规模化养殖方式还是采用本专利技术提供的特定专用培养基的富集胁迫规模化养殖方式中均确认得到微藻外泌体，通过电镜确认用以上传统规模化养殖和富集胁迫规模化养殖方法的雨生红球藻和三角褐指藻的外泌体颗粒大小均符合外泌体的特征。
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1.一种微藻外泌体的制备方法，其特征在于，所述微藻外泌体的制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，所述微藻种类包括所有真核类微藻。
3.根据权利要求1所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，当微藻种类为雨生红球藻时，所述二级胁迫扩增培养阶段包括以下过程：
4.根据权利要求3所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，所述第一专用培养基中含有：NaCl 2.000g/L、FeCl3 0.500g/L和NaHCO3 0.200g/L。
5.根据权利要求1所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，当微藻种类为三角褐指藻时，所述二级胁迫扩增培养阶段包括以下过程：
6.根据权利要求5所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，所述第二专用培养基中含有：富马酸钠0.500g/L、葡萄糖5.00g/L和NaHCO3 0.200g/L。
7.根据权利要求1所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，所述育种培养阶段的工作参数包括：培养时间为7～10d，培养温度为20～25℃，pH为6.5～7.5，
8.根据权利要求1所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，将所述第三培养液进行离心分离，得到上清液；后将所述上清液进行切向流过滤分离，得到所述微藻外泌体的步骤包括以下过程：
9.一种微藻外泌体，其特征在于，所述微藻外泌体是采用权利要求1～8任一项所述的制备方法制得。
10.根据权利要求9所述的微藻外泌体，其特征在于，当微藻种类为雨生红球藻时，所述微藻外泌体的平均粒径为30～200nm，浓度≥1.0×1010Particles/mL；当微藻种类为三角褐指藻时，所述微藻外泌体的平均粒径为30～200nm，浓度≥1.0×1010Particles/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种微藻外泌体的制备方法，其特征在于，所述微藻外泌体的制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，所述微藻种类包括所有真核类微藻。
3.根据权利要求1所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，当微藻种类为雨生红球藻时，所述二级胁迫扩增培养阶段包括以下过程：
4.根据权利要求3所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，所述第一专用培养基中含有：nacl 2.000g/l、fecl3 0.500g/l和nahco3 0.200g/l。
5.根据权利要求1所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，当微藻种类为三角褐指藻时，所述二级胁迫扩增培养阶段包括以下过程：
6.根据权利要求5所述的微藻外泌体的制备方法，其特征在于，所述第二专用培养基中含有：富马酸钠0.500g/l、葡萄糖5.00g/l和nahco3 0.200g/l。
7.根据权利要求1所述的微藻外泌体的制备方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁岚，史会帅，沈萩荻，焦建，
申请(专利权)人：德和上海生物研发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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