【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物合成及蛋白质工程，具体涉及一种多单元启动高效表达重组蛋白的载体及其构建方法。
技术介绍
1、当代遗传学、基因组学及蛋白组学的高速发展，随之而来的重组功能蛋白的市场需求急剧增大，被广泛应用于食品和医药领域，产生了巨大的经济价值与社会效益。为了实现重组蛋白产品的商品化市场需求，首要条件为实现重组蛋白的高效表达，并获得大量高纯度的蛋白质，以便后续对其结构、功能及相互作用进行系统性的分析。通常对表达系统进行改造优化是实现重组蛋白的高效表达的主要策略。表达系统的改造优化往往费时费力，且最终的结果难以评估。
2、目前，基于载体构建方面的策略来增强重组蛋白的表达已有研究，一般方法为更换不同的载体骨架、不同的启动子元件等，但表达量依然没有显著的提升，载体构建的方式较为单一。开发一种新颖的表达载体构建方法来实现重组蛋白的高效表达十分有意义。
3、申请号为：cn201210579512.9的专利公开了一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法。该重组表达载体的获得方法是:按照毕赤酵母密码子偏好性重新设计金属硫蛋白的编码序列，将所设计的金属硫蛋白基因插入载体pao815上的ecori位点后，得到含单拷贝金属硫蛋白表达盒的表达载体，用限制性内切酶bglii及bamhi从得到的单拷贝表达载体上分离金属硫蛋白表达盒，将其再次插入到单拷贝表达载体的bamhi位点，得到两个金属硫蛋白表达盒串联在一起的表达载体，重复上述插入程序构建出多拷贝表达的金属硫蛋白表达盒数目逐渐增加的重组表达载体。将构建的重组
4、申请号为：cn201610809189.8的专利公开了一种可增强目的基因表达的非融合表达载体及其制备方法。所述的可增强目的基因表达的非融合表达载体，是一种可增强目的基因表达的非融合表达载体。研究发现ctb与gst连接而引入的gst可以诱导大大增加多克隆位点2的蛋白的可溶性表达；改专利技术的首要目的在于提供一种可增强目的基因表达的非融合表达载体；可以实现与之非融合的胞内其它外源基因的可溶性表达；该专利技术提供一种新型高效的实现蛋白可溶性表达的原核表达系统，是通过非融合gst来增加表达，与本专利的构建方式相差较大。
5、基于上述
技术介绍
中的问题，本专利技术拟开发一种表达量远高于正常表达载体的表达载体。
技术实现思路
1、本专利技术公开了一种多单元启动高效表达重组蛋白的载体及其构建方法。该方法主要以载体构建为主，以合成生物学设计策略，在pet30a的载体上进行改造，分别导入多个启动单元，优选2个启动单元t7-rbs-p-t7-rbs-p(简称2p)、3个启动单元t7-rbs-p-rbs-p-t7-rbs-p(简称3p)或4个启动单元t7-rbs-p-rbs-p-t7-rbs-p-rbs-p(简称4p)。获得的多启动单元表达载体转化大肠杆菌底盘，表达量远远高于现有的正常表达载体。这将为重组蛋白实现高表达提供新的设计思路。
2、具体而言，本专利技术的多单元启动高效表达重组蛋白的载体及其构建方法如下：
3、一种多单元启动高效表达重组蛋白的载体，是以pet30a质粒为骨架，插入至少2个启动单元，优选设计合成2个启动单元t7-rbs-p-t7-rbs-p、3个启动子单元t7-rbs-p-rbs-p-t7-rbs-p及4个启动子单元t7-rbs-p-rbs-p-t7-rbs-p-rbs-p。其中t7表示t7启动子元件，rbs为大肠杆菌表达体系核糖体结合位点，p为表达盒中的目标蛋白序列，具体的序列信息如seq id no.1-4所示，其中seq id no.1为t7的序列信息，seq id no.2-4为不同rbs的序列信息。
4、所述的一种多单元启动高效表达重组蛋白的载体的构建方法，是将设计的多启动单元以sphi和xhoi双酶切位点插入pet30a质粒骨架。
5、所述的重组蛋白可以为一类蛋白，具体为重组成纤维细胞生长因子21类似物或有重复序列特征的类胶原蛋白，其相应的多单元启动构建的核苷酸序列如seq id no.5-12所示。
6、一种多单元启动高效表达重组蛋白的载体的构建方法，其构建设计中每个目标蛋白的序列前都含有符合3个碱基密码子翻译原则的rbs区域，来确保目标蛋白的成功表达。构建设计中的rbs为适用于大肠杆菌底盘的多种核糖体结合位点。
7、所述的多单元启动高效表达重组蛋白的载体，含有目标蛋白基因的多启动单元，表达载体导入大肠杆菌宿主bl21(de3)细胞中表达，并对蛋白的表达水平进行分析，最终获得高效表达重组蛋白的工程菌株。
8、本专利技术的有益效果：
9、与现有技术相比，本专利技术的多单元启动高效表达重组蛋白的载体及其构建方法，获得的多启动单元表达载体转化大肠杆菌底盘，表达量远远高于常规表达载体，在大肠杆菌中实现了2～6倍的高效表达。
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1.一种多单元启动高效表达重组蛋白的载体，其特征在于，以pET30a质粒为骨架，插入片段为至少2个启动单元T7-RBS-P-T7-RBS-P，其中T7为启动子元件，RBS为大肠杆菌表达体系核糖体结合位点，P为表达盒中的目标蛋白序列，所述T7的序列信息如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，以pET30a质粒为骨架，插入片段为2个启动单元T7-RBS-P-T7-RBS-P、3个启动单元T7-RBS-P-RBS-P-T7-RBS-P及4个启动单元T7-RBS-P-RBS-P-T7-RBS-P-RBS-P，分别得到序列信息如SEQ ID NO.5-12所示的载体。
3.一种如权利要求1或2所述载体的构建方法，其特征在于：将多启动单元以SphI和XhoI双酶切位点插入pET30a质粒骨架。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法中每个目标蛋白的序列前都含有符合3个碱基密码子翻译原则的RBS区域，以使目标蛋白成功表达。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，构建设计中的RBS为适用
6.根据权利要求1所述的重组蛋白的载体，其特征在于，所述的重组蛋白为一类蛋白，具体为重组成纤维细胞生长因子21类似物或有重复序列特征的类胶原蛋白。
7.根据权利要求6所述的重组蛋白载体，其特征在于，重组蛋白载体含有目标蛋白基因的多启动单元，将所述表达载体导入大肠杆菌宿主BL21(DE3)细胞中，培养细菌并分析蛋白的表达水平，最终获得高效表达重组蛋白的工程菌株。
...【技术特征摘要】
1.一种多单元启动高效表达重组蛋白的载体，其特征在于，以pet30a质粒为骨架，插入片段为至少2个启动单元t7-rbs-p-t7-rbs-p，其中t7为启动子元件，rbs为大肠杆菌表达体系核糖体结合位点，p为表达盒中的目标蛋白序列，所述t7的序列信息如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，以pet30a质粒为骨架，插入片段为2个启动单元t7-rbs-p-t7-rbs-p、3个启动单元t7-rbs-p-rbs-p-t7-rbs-p及4个启动单元t7-rbs-p-rbs-p-t7-rbs-p-rbs-p，分别得到序列信息如seq id no.5-12所示的载体。
3.一种如权利要求1或2所述载体的构建方法，其特征在于：将多启动单元以sphi和xho...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，叶贤龙，刘龙英，宁诺漪，徐思梦，
申请(专利权)人：赣江中药创新中心，
类型：发明
国别省市：
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