【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及医药检测领域，具体涉及了一种快速检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的方法及其检测试剂盒。
技术介绍
1、幽门螺杆菌(helicobacter pylori，h.pylori)是一种明确的致癌微生物，一旦感染，患者的胃癌发生率明显增高。全球各地的医疗机构均指出，一旦检出h.pylori感染，患者均应接受抗生素根除治疗。克拉霉素是目前治疗h.pylori感染的一线抗生素。然而，目前全球的h.pylori均面临着严重的耐药性问题，尤其对克拉霉素的耐药率逐年升高，因此，h.pylori感染患者有必要在诊断时即进行抗生素敏感性测试，并根据药敏检测结果选择用药。
2、目前对h.pylori克拉霉素耐药的检测方法包括药敏检测、基因测序、利用taqman探针的实时荧光pcr法等。药敏检测是评估h.pylori对克拉霉素耐受性的金标准方法，该方法是通过观察在抗生素压力下h.pylori培养时微生物量的变化从而判断菌株耐药性的检测方式；基因测序是通过设计不同的测序引物，对待检测的h.pylori进行目标基因片段的扩增及sanger测序获得目标基因序列，继而通过比对判断待测菌株与h.pylori已知耐药基因突变的一致性，从而判断菌株的耐药性；而taqman探针实时荧光pcr法则借助荧光定量pcr的检测平台，通过设计检测基因突变位点的在靶向探针，在pcr反应时检测荧光信号的有无从而判断菌株是否存在耐药突变，进而推测菌株对抗生素的耐受性。
3、虽然药敏检测是目前h.pylori耐药检测的金标准，但是实际操作中，由于h.
4、目前，对h.pylori耐药基因点突变的快速检测是目前h.pylori耐药检测开发的重点。与类似，中国专利技术专利cn111850154a也公开了一种通过设计荧光探针检测h.pylori克拉霉素耐药突变23s rrna基因a2143g突变检测。然而，目前这些检测方案所用的荧光探针合成费用高昂(10nmol/l约2500元)，平均每次检测需要70～100元/反应，且短序列荧光探针的特异性较低，而长序列探针的检测又可能受检测目标附近无义突变影响，这些局限也限制了这些试剂盒在临床上的大规模应用。近年来，研究者们开发了基于饱和荧光染料嵌合法如高分辨溶解曲线分析(high resolution melting analysis，hrm)的基因突变快速检测方案：双链dna的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，而序列变化会导致升温过程中dsdna解链行为的改变，若待检测的目标基因中出现了基因点突变，该片段在rt-pcr溶解过程中产生的荧光信号会出现变化，而通过观测溶解曲线解链温度(tm)的差别即可进行目标片段突变基因点的分类。与探针法相比，hrm的检测费用低廉，结果读取方便，具有更好的应用前景。目前，我国也有研究者利用hrm开发检测菌株对于四环素耐药的检测方案(cn202210282373.7)，但是对于h.pylori的一线治疗用药克拉霉素却暂无类似的检测方案。本专利技术通过设计一对特异性引物，并优化实验方案，开发了一套利用hrm检测h.pylori对克拉霉素耐药性的方法，具有具有成本低廉、操作简单、特异性好、灵敏性高等优点，对临床诊断幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性具有庞大的应用价值。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种快速、准确、高效及低成本的h.pylori对克拉霉素耐药检测方法。
2、本专利技术解决了现有技术依赖于荧光探针的局限，大大降低了检测的成本。本专利技术在qpcr扩增过程中使用饱和荧光染料与目标位点结合，根据不同碱基形成的溶解曲线差异，区分出对克拉霉素敏感和耐药的h.pylori从而实现菌株耐药的判定。本专利技术基于专利技术团队前期建立的h.pylori菌种资源库获得与克拉霉素耐药相关性最大的基因突变位点，进而通过引物设计、筛选验证及反应体系优化等过程获得一套检测方案，该方案可通过检测后读取解链温度(tm)即可判断菌株对克拉霉素是否耐药。本专利技术可在2h内实现对多个含h.pylori的样本克拉霉素耐药检测，为临床工作中h.pylori的耐药检测提供快速、高效且价格低廉的检测方案。
3、本专利技术的第一个目的在于提供h.pylori对克拉霉素耐药的23s rrna基因突变基因检测的特异性引物23s-4f：5’-ttgtagtggaggtgaaaattcctc-3’和23s-4r：5’-acctttactacaacttagcactgct-3’。利用该引物联合饱和荧光染料，可实现更快更准确地检测幽门螺杆菌对克拉霉素的能力。
4、本专利技术的第二个目的在于提供一种快速检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的方法，其是利用上述特异性引物对幽门螺杆菌样品进行pcr扩增，扩增结束后进行熔解曲线分析。
5、优选，所述的pcr扩增，其pcr扩增程序为：95℃预变性2min；95℃10sec，55℃～65℃20sec，72℃30sec交替循环40次；扩增结束后增加高分辨熔解曲线程序：95℃60sec，40℃60sec，65℃1sec，97℃1sec，在熔解曲线分析时，设置为0.02～0.1℃收集一次荧光。
6、本专利技术的第三个目的在于提供一种快速判别h.pylori对克拉霉素耐药性的方法，其特征在于，应用上述引物进行荧光定量pcr检测，当检测tm值为79.43±0.2℃时，2143位点的碱基为a，所检测菌株对克拉霉素敏感；当检测tm值为80.11±0.2℃，2143位点的碱基为g，所检测菌株对克拉霉素耐药。
7、本专利技术的第四个目的在于提供一种快速检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的检测试剂盒，其特征在于，包含上述特异性引物。
8、与已有h.pylori的耐药检测相比，本专利技术的优势在于：
9、(1)经差异作图算法处理溶解曲线分辨差异明显；
10、(2)能够准确地分辨23s rrna基因的野生型a碱基到突变型g碱基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种H.pylori对克拉霉素耐药的23SrRNA基因突变基因检测的特异性引物，其特征白玉，包括：23S-4F：5’-TTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTC-3’和23S-4R：5’-ACCTTTACTACAACTTAGCACTGCT-3’。
2.一种快速检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的特异性引物对幽门螺杆菌样品进行PCR扩增，扩增结束后进行熔解曲线分析。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增，其PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃10sec，55℃～65℃20sec，72℃30sec交替循环40次；扩增结束后增加高分辨熔解曲线程序：95℃60sec，40℃60sec，65℃1sec，97℃1sec，在熔解曲线分析时，设置为0.02～0.1℃收集一次荧光。
4.一种快速判别H.pylori对克拉霉素耐药性的方法，其特征在于，应用权利要求1所述的引物进行荧光定量PCR检测，当检测Tm值为79.43±0.2℃时，2143位点的碱基为A，所检测菌株对克拉霉素敏感；当
5.一种快速检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的特异性引物。
...【技术特征摘要】
1.一种h.pylori对克拉霉素耐药的23srrna基因突变基因检测的特异性引物，其特征白玉，包括：23s-4f：5’-ttgtagtggaggtgaaaattcctc-3’和23s-4r：5’-acctttactacaacttagcactgct-3’。
2.一种快速检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的特异性引物对幽门螺杆菌样品进行pcr扩增，扩增结束后进行熔解曲线分析。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增，其pcr扩增程序为：95℃预变性2min；95℃10sec，55℃～65℃20sec，72℃30s...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴清平，邝祖鹏，李滢，吴毓薇，赵昕宇，陈惠元，谢新强，吴磊，赵辉，高鹤，梁婷婷，张菊梅，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：
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