【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及治疗性反义寡核苷酸及其缀合物和组合物，所述治疗性反义寡核苷酸结合至人类肌养蛋白前体mrna的外显子51以诱导外显子跳跃(exon skipping)。本专利技术还涉及所述反义寡核苷酸用于治疗肌肉紊乱(muscular disorder)特别是杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy)的方法和用途。
技术介绍
0、背景
1、可变剪接(alternative splicing)的破坏是许多疾病的基础，而使用反义寡核苷酸调控剪接可以具有治疗意义。剪接转换反义寡核苷酸(splice-switching antisenseoligonucleotide；sso)是用于神经肌肉疾病的新兴治疗，目前若干种sso正在进行临床试验以用于诸如脊髓性肌萎缩症(sma)和杜氏肌营养不良症(dmd)的状况，其中反义介导的外显子跳跃可以恢复开放阅读框，并允许具有部分或全部功能的蛋白而不是无功能的蛋白的合成。
2、杜氏肌营养不良症(dmd)是世界范围内的男童中最普遍的致死性遗传紊乱之一，发病率为约3,600-9,337名活产男性中有1名。dmd是由肌养蛋白(dmd)基因中的突变导致的肌养蛋白缺乏引起的。编码该蛋白的基因包含79个外显子，分布在多于200万个核苷酸的dna上。任何改变外显子阅读框或引入终止密码子、或者特征为使一个或更多个外显子完全移出阅读框或一个或更多个外显子的重复的外显子突变，都有可能破坏功能性肌养蛋白的产生，导致dmd。一种不太严重的肌营养不良症形式，贝克肌营养不良症(b
3、目前最有前景的治疗途径之一是使用反义寡核苷酸(ao)的外显子跳跃。外显子跳跃可以通过从dmd前体mrna中去除突变外显子和/或其侧翼外显子来恢复阅读框，使得能够产生截短但具有部分功能的肌养蛋白。大多数dmd患者存在缺失突变，并且其中20％属于外显子51跳跃。
4、在2016年9月，美国食品和药物管理局(fda)有条件地批准了第一种dmd反义药物eteplirsen(exondys 51)，其被开发以从突变dmd中排除外显子51。eteplirsen是一种用磷二酰胺吗啉代寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer)(吗啉代或pmo)修饰的ao，其是一种在其安全性和有效性方面已经被良好确认的反义化学物质。然而，eteplirsen仍然有争议，因为在使肌养蛋白恢复到治疗上有益的水平和改善临床结果两个方面仅有较弱证据支持该药物的有效性。fda先前已经驳回了另一种用于dmd外显子51跳跃的候选药物：基于2'-o-甲基-硫代磷酸酯的ao“drisapersen”。尽管治疗剂必须确保最低风险量的最高可能益处，但是在用drisapersen治疗后未显示出肌肉功能的显著改善，而其使用导致的担忧超过了安全性。
5、因此，外显子跳跃疗法目前面临重大挑战，原因在于尽管存在在许多动物研究中已经显示出显著的治疗效果的事实，但它们在患者中观察到的疗效非常低。
6、外显子跳跃效率主要取决于ao靶序列；然而，关于eteplirsen和drisapersen所靶向的序列对于外显子跳跃疗法可能不是最佳选择几乎没有争论或讨论。若干小组已经进行了大规模ao筛选工作，以在计算上和凭经验地确定有效的ao序列。然而，设计的ao的外显子跳跃有效性尚未被定量地和在统计上评估。尽管恢复肌养蛋白表达对于改善营养不良性(dystrophic)肌肉功能是必要的，但在先前的ao筛选研究中，尚未以足够的定量方法报道ao挽救肌养蛋白表达的能力。其他研究高度依赖于来自原代dmd肌细胞的rt-pcr。值得注意的是，eteplirsen和drisapersen的ao序列是仅在这种情况下被确定的。
7、因此，通过选择更佳的ao序列，并且通过使用更可靠和直接的生物学测量——诸如在dmd中经挽救的肌养蛋白——进行更严格的ao筛选以验证临床试验中待采用的最佳反义寡核苷酸，可以提高外显子51跳跃疗法的有效性。
8、本专利技术的一个或更多个方面的目的是解决本领域中的一个或更多个这样的问题。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、根据本专利技术的第一方面，提供了能够结合至人类肌养蛋白前体mrna的外显子51的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的结合完全发生在前体mrna序列的0和+89之间的区域内，并且其中反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
2、根据本专利技术的第二方面，提供了包含根据第一方面的反义寡核苷酸和载体的缀合物，其中载体缀合至反义寡核苷酸。
3、根据本专利技术的第三方面，提供了装载有第二方面的缀合物的细胞。
4、根据本专利技术的第四方面，提供了药物组合物，其包含根据第一方面的反义寡核苷酸和/或根据第二方面的缀合物以及药学上可接受的赋形剂。
5、根据本专利技术的第五方面，提供了治疗受试者的肌肉紊乱的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的能够结合至人类肌养蛋白前体mrna的外显子51的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的结合完全发生在前体mrna序列的0和+89之间的区域内，并且其中反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
6、根据本专利技术的第六方面，提供了能够结合至人类肌养蛋白前体mrna的外显子51的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸用于治疗受试者的肌肉紊乱，其中反义寡核苷酸的结合完全发生在前体mrna序列的0和+89之间的区域内，并且其中反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
7、根据本专利技术的第七方面，提供了增加细胞中人类肌养蛋白表达的方法，所述方法包括使细胞与有效量的能够结合至人类肌养蛋白前体mrna的外显子51的反义寡核苷酸接触，其中反义寡核苷酸的结合完全发生在前体mrna序列的0和+89之间的区域内，并且其中反义寡核苷酸包含至少27个碱基。
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1.一种反义寡核苷酸，其序列为SEQ ID NO.3(Ac26)、SEQ ID NO.4(Ac30)或SEQ IDNO.5(Ac48)。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的序列为SEQ ID NO.3(Ac26)。
3.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为吗啉代的寡核苷酸。
4.一种缀合物，所述缀合物包含根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡核苷酸和载体，其中所述载体缀合至所述反义寡核苷酸。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述载体是可操作的，以将所述反义寡核苷酸转运到靶细胞中。
6.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述载体选自肽、小分子化学物质、聚合物、纳米颗粒、脂质、脂质体或外泌体。
7.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述载体是细胞穿透肽或脂质体。
8.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述载体是富含精氨酸的细胞穿透肽。
9.一种细胞，所述细胞装载有根据权利要求4-8中任一项所述的缀合物。
10.一种药物组合物，所述药物
11.根据权利要求1-3之一所述的反义寡核苷酸在制备用于治疗受试者的肌肉紊乱的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述反义寡核苷酸为吗啉代的寡核苷酸。
13.根据权利要求11或12所述的用途，其中所述的肌肉紊乱是由与肌肉功能相关的基因中的基因突变导致的紊乱。
14.根据权利要求11或12所述的用途，其中所述肌肉紊乱是杜氏肌营养不良症或贝克肌营养不良症。
15.根据权利要求1-3之一所述的反义寡核苷酸在制备用于增加细胞中人类肌养蛋白表达的药物中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述反义寡核苷酸为吗啉代的寡核苷酸。
17.一种反义寡核苷酸，其序列为SEQ ID NO.13(Ac9)、SEQ ID NO.14(Ac141)或SEQ IDNO.15(Ac207)。
18.根据权利要求17所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的序列为SEQ IDNO.13(Ac9)。
19.根据权利要求17所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为吗啉代的寡核苷酸。
20.一种缀合物，所述缀合物包含根据权利要求17-19中任一项所述的反义寡核苷酸和载体，其中所述载体缀合至所述反义寡核苷酸。
21.根据权利要求20所述的缀合物，其中所述载体是可操作的，以将所述反义寡核苷酸转运到靶细胞中。
22.根据权利要求20所述的缀合物，其中所述载体选自肽、小分子化学物质、聚合物、纳米颗粒、脂质、脂质体或外泌体。
23.根据权利要求20所述的缀合物，其中所述载体是细胞穿透肽或脂质体。
24.根据权利要求20所述的缀合物，其中所述载体是富含精氨酸的细胞穿透肽。
25.一种细胞，所述细胞装载有根据权利要求20-24中任一项所述的缀合物。
26.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求17-19中任一项所述的反义寡核苷酸和/或根据权利要求20-24中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的赋形剂。
27.根据权利要求17-19之一所述的反义寡核苷酸在制备用于治疗受试者的肌肉紊乱的药物中的用途。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述反义寡核苷酸为吗啉代的寡核苷酸。
29.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述的肌肉紊乱是由与肌肉功能相关的基因中的基因突变导致的紊乱。
30.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述肌肉紊乱是杜氏肌营养不良症或贝克肌营养不良症。
31.根据权利要求17-19之一所述的反义寡核苷酸在制备用于增加细胞中人类肌养蛋白表达的药物中的用途。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述反义寡核苷酸为吗啉代的寡核苷酸。
...【技术特征摘要】
1.一种反义寡核苷酸，其序列为seq id no.3(ac26)、seq id no.4(ac30)或seq idno.5(ac48)。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的序列为seq id no.3(ac26)。
3.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为吗啉代的寡核苷酸。
4.一种缀合物，所述缀合物包含根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡核苷酸和载体，其中所述载体缀合至所述反义寡核苷酸。
5.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述载体是可操作的，以将所述反义寡核苷酸转运到靶细胞中。
6.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述载体选自肽、小分子化学物质、聚合物、纳米颗粒、脂质、脂质体或外泌体。
7.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述载体是细胞穿透肽或脂质体。
8.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述载体是富含精氨酸的细胞穿透肽。
9.一种细胞，所述细胞装载有根据权利要求4-8中任一项所述的缀合物。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡核苷酸和/或根据权利要求4-8中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的赋形剂。
11.根据权利要求1-3之一所述的反义寡核苷酸在制备用于治疗受试者的肌肉紊乱的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述反义寡核苷酸为吗啉代的寡核苷酸。
13.根据权利要求11或12所述的用途，其中所述的肌肉紊乱是由与肌肉功能相关的基因中的基因突变导致的紊乱。
14.根据权利要求11或12所述的用途，其中所述肌肉紊乱是杜氏肌营养不良症或贝克肌营养不良症。
15.根据权利要求1-3之一所述的反义寡核苷酸在制备用于增加细胞中人类肌养蛋白表达的药物中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述反义寡核苷酸为吗啉代的寡核苷酸。
17.一种反义寡核苷酸，...
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