【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体涉及一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用。
技术介绍
1、f4ac菌毛的产肠毒素性大肠杆菌(etec)是引起新生仔猪细菌性腹泻的主要病原微生物，研究报告表明etec需要通过菌毛黏附至宿主细胞，附着后通过分泌的蛋白质来破坏宿主细胞，操纵宿主细胞的信号传导途径，避免宿主细胞产生免疫反应并成功定植，释放毒素，导致肠道内电解质平衡紊乱，最终导致腹泻。
2、仔猪对etec f4ac的易感性由小肠上皮表面的特异性受体决定。本课题组前期选取4对etec f4ac抗性和易感的全同胞仔猪为试验对象，采用itraq蛋白质组定量技术鉴定其小肠蛋白表达差异，结果富集到唯一的整合素信号通路(integrin signallingpatinway：po0034)，说明该通路对etec f4acr感染仔猪小肠黏膜进而引起仔猪腹泻具有重要作用，从基因位于染色体上的位置、基因的分子功能、基因的蛋白质分子量大小角度对候选基因进行分化，发现itgb5最有可能为etec f4acr的候选基因。itgb5属于整合素家族成员，整合蛋白是参与细胞黏附的细胞表面受体，是通过细胞表面介导细菌黏附的粘连蛋白。itgb5编码整合蛋白的β亚基，编码细胞表面糖蛋白，其主要功能为参与免疫细胞的黏附作用，它的作用机制是调节邻近细胞或胞外基质的黏附分子。经过搜寻鉴别itgb5基因单核苷酸多样性，并分析itgb5基因多态性与黏附表型的关联性，我们发现这些位点与黏附的关联性较强，itgb5基因的缺失会显著降低黏附到ipec-j2细胞上的e
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用。本专利技术是通过利用itgb5基因flox小鼠与组织特异性表达cre重组酶(vil-cre)的小鼠交配后，其后代flox纯合、cre阳性小鼠的flox区域被敲除，导致itgb5基因在肠道组织类型中功能性缺失，获得条件性基因敲除(conditional knockout，cko)小鼠，为有目的地研究itgb5基因对etec f4ac黏附导致腹泻的作用机制提供理想的动物模型。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面，提供一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
4、(1)确定小鼠待敲除基因的靶位点，设计针对itgb5基因的grna，所述grna的序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示；
5、(2)构建同源重组载体，所述同源重组载体包括：5’同源臂、flox区域和3’同源臂；
6、(3)将cas9 mrna、grna和同源重组载体注射到小鼠的受精卵中，取存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出f0代小鼠，对f0代小鼠进行鉴定；
7、(4)将阳性的f0代小鼠与野生型小鼠交配获得f1代小鼠，对f1代小鼠进行鉴定；
8、(5)将步骤(4)得到的含有打靶序列的杂合性f1代小鼠与vil-cre重组酶阳性小鼠杂交获得f2代小鼠，对f2代小鼠进行鉴定，得到itgb5条件性基因敲除小鼠模型。
9、进一步的，步骤(2)中，flox区域序列如seq id no.3所示。
10、进一步的，步骤(2)中，5’同源臂序列和3’同源臂序列分别如seq id no.4和seqid no.5所示。
11、进一步的，步骤(3)中，对产出f0代小鼠进行pcr鉴定，其中，
12、5’同源臂重组pcr鉴定所用引物对序列为seq id no.6和seq id no.7；
13、3’同源臂重组pcr鉴定所用引物对序列为seq id no.8和seq id no.9。
14、进一步的，步骤(4)中，对f1代小鼠进行flox位点pcr鉴定，鉴定所用引物对序列为seq id no.10和seq id no.11。
15、进一步的，步骤(5)中，对f2代小鼠进行flox位点pcr鉴定，鉴定所用引物对序列为seq id no.10和seq id no.11。
16、进一步的，步骤(5)中，对f2代小鼠进行cre作用效果pcr鉴定，鉴定所用引物对序列为seq id no.12和seq id no.13。
17、进一步的，步骤(5)中，对f2代小鼠进行肠道基因型qrt-pcr鉴定，鉴定所用引物对序列为seq id no.14和seq id no.15。
18、本专利技术的第二方面，提供一种条件性基因敲除小鼠模型，所述条件性基因敲除小鼠模型由所述的构建方法构建得到。
19、本专利技术的第三方面，提供所述的条件性基因敲除小鼠模型在etec f4ac黏附导致腹泻的作用机制研究中的应用
20、本专利技术的有益效果：
21、(1)本专利技术是通过利用itgb5基因flox小鼠与组织特异性表达cre重组酶(vil-cre)的小鼠交配后，其后代flox纯合、cre阳性小鼠的flox区域被敲除，导致itgb5基因在肠道组织类型中功能性缺失，获得条件性基因敲除(conditional knockout，cko)小鼠，为有目的地研究itgb5基因对etec f4ac黏附导致腹泻的作用机制提供理想的动物模型。
22、(2)本专利技术构建得到的itgb条件性基因敲除小鼠模型为进一步研究itgb5基因的生物学功能奠定了基础，为特异性针对itgb5基因的研究提供了理想模型，减少了全身敲除引起的其他机制的变化。本专利技术用小鼠模型模拟仔猪腹泻，为仔猪腹泻的致病机理研究和通过转基因技术对仔猪腹泻抗性基因进行功能验证奠定基础。
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1.一种ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，flox区域序列如SEQ ID No.3所示。
3.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，5’同源臂序列和3’同源臂序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。
4.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，对产出F0代小鼠进行PCR鉴定，其中，
5.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，对F1代小鼠进行flox位点PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11。
6.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，对F2代小鼠进行flox位点PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.10和SEQ IDNo.
7.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，对F2代小鼠进行Cre作用效果PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.12和SEQID No.13。
8.根据权利要求1所述ITGB5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，对F2代小鼠进行肠道基因型qRT-PCR鉴定，鉴定所用引物对序列为SEQ ID No.14和SEQ ID No.15。
9.一种条件性基因敲除小鼠模型，其特征在于，所述条件性基因敲除小鼠模型由权利要求1-8任一项所述的构建方法构建得到。
10.权利要求9所述的条件性基因敲除小鼠模型在ETEC F4ac黏附导致腹泻的作用机制研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述itgb5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，flox区域序列如seq id no.3所示。
3.根据权利要求1所述itgb5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，5’同源臂序列和3’同源臂序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示。
4.根据权利要求1所述itgb5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，对产出f0代小鼠进行pcr鉴定，其中，
5.根据权利要求1所述itgb5条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，对f1代小鼠进行flox位点pcr鉴定，鉴定所用引物对序列为seq id no.10和seq idno.11。
6.根据权利要求1所述itgb5条件性基因敲除...
【专利技术属性】
技术研发人员：王文文，李晓敏，唐辉，张勤，曾勇庆，范庆花，马晓云，李明辉，冯玉莲，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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