【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术提供多特异性t细胞募集多肽，其包含一个特异性结合t细胞受体(tcr)的恒定结构域的免疫球蛋白单可变结构域，和一个或多个结合靶细胞上表达的cd123的免疫球蛋白单可变结构域。本专利技术还涉及用于这些多特异性多肽的单价cd123结合多肽。本专利技术还提供了编码所述多肽的核酸以及用于产生本专利技术多肽的载体、宿主和方法。本专利技术还涉及利用本专利技术多肽的治疗方法和提供本专利技术多肽的试剂盒。
技术介绍
1、cd123(白介素3受体的α亚基，il-3ra)是75kda糖蛋白，其在用n-糖苷酶消化后变为43kda(sato等，1993，blood 82：752-761)。cd123由三个细胞外结构域、跨膜结构域和短细胞内区域组成。n-端细胞外结构域对于cd123与il-3的相互作用有显著贡献，而细胞内区域是信号传导所必需的(barry等，1997，blood 89：842-852)。cd123以低亲和力特异性结合il-3。cd123与本身不与il-3结合的共同β(βc)亚基的异二聚化导致il-3r的形成，il-3r是il-3的高亲和力受体。βc亚基在信号转导中起重要作用，并因此触发一系列生物学功能(hara等，1996stem cells 14：605-618)。
2、虽然βc亚基在各种细胞的表面上表达，但cd123表达更受限于il-3应答细胞，例如造血干/祖细胞、单核细胞、巨核细胞、b淋巴细胞和浆细胞性树突细胞。il-3的结合刺激造血细胞的增殖和分化。在这些细胞成熟期间，cd123表达逐渐降低，并且在
3、据报道，cd123在白血病干细胞(lsc)上高表达，并且与许多疾病的发生和发展有关，例如急性髓性白血病(aml)、急性淋巴细胞白血病(all)和毛细胞白血病(hcl)。参考liu等人的综述(2015life sciences 122：59-64)了解有关cdl23和在白血病中相关的临床应用的更多细节。鉴于正常造血干细胞和lsc上cd123表达的差异，cd123是血液癌症中令人关注的治疗靶点。
4、aml是一种克隆性恶性疾病，来自具有cd123过表达的lsc细胞的小群体。aml的特征在于骨髓和外周血中骨髓祖细胞的增殖，并导致正常造血作用的破坏。尽管多年来对aml患者的治疗方案和支持性护理有所改善，但在过去三十年中，标准治疗选择并没有发生重大变化。参考medinger等人(2016leukemia research reports 6：39-49)对aml的新方法和治疗选择的概述。目前，只有35-40％的年龄小于60岁的患者可以治愈所述疾病。对于老年患者(＞60岁)，总体预后仍然不利。目前，同种异体造血干细胞移植提供最佳的治愈机会。因此，仍然需要治疗aml的新疗法。
5、预防aml和治疗复发的可能策略是使用免疫疗法，其是癌症研究的快速发展领域。免疫疗法将身体的免疫监视系统并且特别是t细胞引导至癌细胞。
6、细胞毒性t细胞(ctl)是杀死癌细胞、被感染(特别是被病毒感染)的细胞或以其他方式受损的细胞的t淋巴细胞。t淋巴细胞(或t细胞)在细胞表面上表达t细胞受体或tcr分子和cd3受体。αβtcr-cd3复合物(或“tcr复合物”)由六种不同的i型单跨越(single-spanning)跨膜蛋白组成：形成负责配体识别的tcr异二聚体的tcrα和tcrβ链，以及非共价缔合的cd3γ、cd3δ、cd3ε和ζ链(它们带有在受体活化时被磷酸化的细胞质序列基序并募集大量信号传导组分)(call等，2004，molecular immunology 40：1295-1305)。
7、t细胞受体的α链和β链均由恒定结构域和可变结构域组成。在生理学上，t细胞受体的αβ链识别载有肽的mhc复合物，并在与cd3链接合时偶联。这些cd3链随后将接合信号转导至细胞内环境。
8、考虑到天然存在的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)介导细胞溶解的潜力，已经探索了各种策略来募集免疫细胞以介导肿瘤细胞杀伤。然而，特异性t细胞应答的引发依赖于癌细胞对mhc分子的表达以及特异性肽抗原的存在、产生、转运和展示。较新的发展已经尝试了备选的方法，其通过经由基于重组抗体的“双特异性抗体”技术以多克隆方式接合患者的所有t细胞来组合免疫疗法与抗体疗法的优点。
9、已经设计了双特异性抗体，其在一个臂(靶标结合臂)上具有肿瘤识别部分，而该分子的另一个臂对t细胞抗原(效应子结合臂)(主要是cd3)具有特异性。通过将两个臂同时结合到它们各自的抗原上，t淋巴细胞被导向肿瘤细胞并在肿瘤细胞处活化，在那里它们可以发挥其细胞溶解功能
10、使用双特异性抗体来活化针对肿瘤细胞的t细胞的概念在20多年前就有描述了，但是制造问题和临床失败使该领域陷入停滞。当开发出由抗体减少为其可变片段而产生的较小形式的双特异性抗体时，取得了进一步的进展。
11、尽管第一种t细胞接合形式，博纳吐单抗(blinatumomab)(识别cd19和cd3的bite分子)于2014年12月被fda批准用于二线治疗，但仍有许多障碍需要克服。博纳吐单抗的首次临床试验由于以下而被过早地停止：在一方面是神经系统不良事件、细胞因子释放综合征和感染，并且在另一方面是缺少生物活性的客观临床反应或强烈迹象。
12、作为aml的治疗选择，macrogenics最近开发了mgd006，一种cd3x cd123双特异性dart(双亲和力重靶向分子)。如hussaini等人(2016blood 127：122-131)所述，mgd006能够识别cd123阳性白血病细胞并诱导t细胞活化，从而在体外和体内杀死过表达cd123的肿瘤细胞。然而，dart还在与cd123阴性细胞系k562gfp温育时上调t细胞上的t细胞活化标记物cd25(图1d，hussaini等人2016)。此外，用两种cd123阴性细胞系观察到靶标独立杀伤(图2b，hussaini等人2016)。因此，使用此dart，可能会出现由这一靶标独立的t细胞活化引起的安全问题。
13、为了使不良事件和全身副作用(如细胞因子风暴)的风险最小化，在选择肿瘤和t细胞抗原臂时务必最大谨慎。t细胞抗原臂必须以单价方式与tcr复合物的恒定结构域结合，并且在不存在靶向癌细胞的情况下可能不会触发t细胞信号传导。只有两臂与其靶标(肿瘤和t细胞抗原)的特异性结合可以触发细胞溶解性突触的形成并随后杀死肿瘤细胞。肿瘤识别臂对其抗原的特异性是避免脱靶结合的必要条件，这将不可避免地导致靶标独立的t细胞活化。
14、除了效力之外，mgd006以及博纳吐单抗的体积非常小并且缺乏fc结构域。因此，mgd006将需要连续静脉输注，这不会有助于患者的依从性。macrogenics目前试图通过将fc结构域融合到其下一代dart上来解决这个问题(wo2015026892)，这使得该分子不仅变得更大，而且还可能导致制造问题和其他fc功能的输入。预计fc的较大形式具有更好的pk，但重新引入了脱靶活性的风险本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.多肽，优选免疫球蛋白单可变结构域(ISV)，其特异性结合CD123，包含分别为FR1至FR4的4个框架区和分别为CDR1至CDR3的3个互补决定区或基本上由分别为FR1至FR4的4个框架区和分别为CDR1至CDR3的3个互补决定区组成，其中
2.根据权利要求1所述的多肽，其中：
3.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽，其中CDR1选自由以下组成的组：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中CDR2为SEQ ID NO:17。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中CDR3选自由以下组成的组：
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中CDR1选自由SEQ ID NO:11-15组成的组，CDR2是SEQ ID NO:17，和CDR3选自由SEQ ID NO:21-22组成的组。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中CDR1是SEQ ID NO:11，CDR2是SEQ IDNO:17，和CDR3是SEQ ID NO:
9.根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中所述多肽是选自SEQ ID NO:1-6的ISV，或者与SEQ ID NO:1-6之一具有大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或甚至大于99％的序列同一性的多肽。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽，其中CDR1是SEQ ID NO:16。
11.根据权利要求1、2或10中任一项所述的多肽，其中CDR2选自由以下组成的组：
12.根据权利要求1、2、10或11中任一项所述的多肽，其中CDR3选自由以下组成的组：
13.根据权利要求1、2或11至12中任一项所述的多肽，其中CDR1为SEQ ID NO:16，CDR2选自由SEQ ID NO:18-20组成的组，和CDR3选自由SEQ ID NO:23-25组成的组，优选其中CDR1是SEQ ID NO:16，CDR2是SEQ ID NO:18，并且CDR3是SEQ ID NO:23。
14.根据权利要求1、2或11至13中任一项所述的多肽，其中所述多肽是选自SEQ ID NO:7-10的ISV，或者是与SEQ ID NO:7-10之一具有大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或甚至大于99％的序列同一性的多肽。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的多肽，其中所述多肽是ISV，该ISV：
16.多肽，其包含两个或更多个特异性结合CD123的ISV或者基本上由两个或更多个特异性结合CD123的ISV组成，其中所述ISV选自根据权利要求9或14中任一项中定义的ISV。
17.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽包含第一ISV和第二ISV，其中第一ISV如权利要求9中限定并且第二ISV如权利要求14中限定，优选地，其中所述第二ISV位于所述第一ISV的N端或者其中所述第二ISV位于所述第一ISV的C端。
18.一种构建体，其包含权利要求1-17中任一项中限定的多肽，并且进一步包含一个或多个的其他基团、残基或结合单元，任选地通过一个或多个肽接头连接，其中与权利要求1-17中任一项中限定的相应多肽相比，所述一个或多个的其他基团、残基或结合单元为所述构建体提供增加的半衰期。
19.根据权利要求15所述的构建体，其中为所述构建体提供增加的半衰期的所述一个或多个其他结合单元选自可与血清白蛋白或血清免疫球蛋白结合的结合单元。
20.根据权利要求19所述的构建体，其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白。
21.根据权利要求19所述的构建体，其中所述血清免疫球蛋白是IgG。
22.一种核酸，其编码权利要求1-17中任一项中限定的多肽或权利要求18至21中任一项中限定的构建体，所述多肽或构建体是这样的：它可以通过表达编码其的核酸而获得，任选地其是遗传构建体的形式。
23.一种宿主或宿主细胞，其包含：权利要求22中限定的核酸或遗传构建体，或者包含权利要求19中限定的核酸和/或遗传构建体的表达载体。
24.用于产生权利要求1-17中任一项中限定的多肽或权利要求18-21中任一项中限定的构建体的方法，所述多肽或构建体是这样的：它可以通过表达编码其的核酸而获得，所述方法至少包括以下步骤：
25.一种组合物，其包含至少一种权利要求1-17中任一项中限定的多肽、或权利要求18-21中任一项中限定的构建体、或权利要求22中限定的核酸。
26.权...
【技术特征摘要】
1.多肽，优选免疫球蛋白单可变结构域(isv)，其特异性结合cd123，包含分别为fr1至fr4的4个框架区和分别为cdr1至cdr3的3个互补决定区或基本上由分别为fr1至fr4的4个框架区和分别为cdr1至cdr3的3个互补决定区组成，其中
2.根据权利要求1所述的多肽，其中：
3.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽，其中cdr1选自由以下组成的组：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中cdr2为seq id no:17。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，其中cdr3选自由以下组成的组：
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽，其中cdr1选自由seq id no:11-15组成的组，cdr2是seq id no:17，和cdr3选自由seq id no:21-22组成的组。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中cdr1是seq id no:11，cdr2是seq idno:17，和cdr3是seq id no:21。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的多肽，其中所述多肽是选自seq id no:1-6的isv，或者与seq id no:1-6之一具有大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或甚至大于99％的序列同一性的多肽。
10.根据权利要求1-2中任一项所述的多肽，其中cdr1是seq id no:16。
11.根据权利要求1、2或10中任一项所述的多肽，其中cdr2选自由以下组成的组：
12.根据权利要求1、2、10或11中任一项所述的多肽，其中cdr3选自由以下组成的组：
13.根据权利要求1、2或11至12中任一项所述的多肽，其中cdr1为seq id no:16，cdr2选自由seq id no:18-20组成的组，和cdr3选自由seq id no:23-25组成的组，优选其中cdr1是seq id no:16，cdr2是seq id no:18，并且cdr3是seq id no:23。
14.根据权利要求1、2或11至13中任一项所述的多肽，其中所述多肽是选自seq id no:7-10的isv，或者是与seq id no:7-10之一具有大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或甚至大于99％的序列同一性的多肽。
15.根据权利要求1至1...
【专利技术属性】
技术研发人员：迪亚娜·范霍里克，安内利斯·罗布鲁克，卡特林恩·斯托特勒斯，若昂·维埃拉，爱德华·麦高恩，
申请(专利权)人：埃博灵克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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