【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白酶检测，具体是涉及一种多肽底物探针及其应用。
技术介绍
1、aerolysin纳米孔是从嗜水气单胞菌中提取的β成孔蛋白，是一种与人体腹泻病症以及深度伤口相关的革兰氏阴性杆菌属，成熟的aerolysin纳米孔可与真核细胞膜表面的糖蛋白受体相结合，并插入细胞膜形成一个孔道，改变细胞膜的通透性并最终导致细胞死亡。在水溶液中aerolysin单体会自发地形成一个具有蘑菇状外形的七聚体结构，宽度为～15nm，高度为～7.0nm，形成的孔道直径为1.0～1.7nm，其形状与目前在纳米孔技术中广泛应用的α-hl类似，但在cis端没有前庭结构。aerolysin纳米孔最早于2006年首次应用于纳米孔生物传感器，进行α-螺旋胶原蛋白结构的研究，随后被用于分析蛋白的折叠和去折叠动力学过程、多肽、蛋白结构、低聚糖的聚集程度和酶降解的动力学等。
2、在过去十年中，使用纳米孔作为在单分子水平上探索各种应用的多功能工具受到了越来越多的关注。纳米孔应用的几个例子包括dna测序、环境监测、疾病检测和细胞代谢研究。在纳米孔传感中，分析物分子在施加的电势偏压下通过电泳效应和/或扩散力驱动通过纳米孔道(生物蛋白质或合成纳米孔)，产生瞬态离子电流调制(事件)。诸如频率、阻塞振幅和停留时间等事件特征可用于揭示分析物的浓度和身份。由于其纳米腔体积小(约1nm)，气溶素纳米孔特别有利于捕获和分析肽探针。近年来，aerolysin纳米孔已被用于研究带不同电荷的肽，并监测酶降解动力学。这些进展表明，aerolysin纳米孔在同时监测多种蛋白酶的活性
3、主蛋白酶(mpro，又称3clpro)和木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro)作为冠状病毒生命周期中必不可少的两种酶，能够同时检测以上两种蛋白酶能够大大提高病毒的检测效率，但现有技术缺乏对上述两种蛋白酶进行同时检测的方法。
技术实现思路
1、本专利技术解决的技术问题是：现有技术缺乏对主蛋白酶和木瓜蛋白酶样蛋白酶进行同时检测的方法。
2、为解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：
3、一种多肽底物探针，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
4、本专利技术还提供一种上述多肽底物探针在同时检测主蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶中的应用。
5、本专利技术还提供一种同时检测主蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶的方法，基于上述多肽底物探针，通过多肽底物探针对人类呼出气冷凝液进行同时检测分析。
6、作为本专利技术的一个方面，多肽底物探针基于aerolysin纳米孔对主蛋白酶和木瓜蛋白酶样蛋白酶进行同时检测分析。
7、作为本专利技术的一个方面，通过delrin双层杯形成脂质双层膜，并通过aerolysin溶液将aerolysin纳米孔蛋白自发插入脂质双分子层中，形成aerolysin纳米孔。
8、作为本专利技术的一个方面，在同时检测分析前，配置aerolysin溶液、储备液、工作溶液，并将储备液、工作溶液与人类呼出气冷凝液混合进行酶促反应。
9、作为本专利技术的一个方面，aerolysin溶液的配置方法为：将浓度为2.0mg/ml的500μl气溶素原溶液与10μl胰蛋白酶-琼脂糖混合，得到混合溶液；将获得的混合溶液以100转每分钟的速度旋转4小时，将无活性的气溶素原转化为气溶素单体蛋白；再将混合溶液在25℃下以10000g离心15分钟后沉淀胰蛋白酶-琼脂糖；将沉淀得到的上清液转移至新管中；重复上述步骤3次，收集最终的上清液，作为活化后的aerolysin溶液，并存储在-20℃温度环境下。
10、作为本专利技术的一个方面：
11、储备液的配置方法为：将多肽底物探针p0及其释放产物片段p1、p2、p3、p1-2和p2-3溶解在超纯水中，以获得p0、p1、p2、p3、p1-2和p2-3的浓度为100μm的储备液，并存储在-20℃温度环境下。
12、工作溶液的配置方法为：将溶解在终浓度为20mm的tris-hcl缓冲液中的10μl多肽底物探针p0用45μl主蛋白酶测定缓冲液和45μl木瓜蛋白酶样蛋白酶测定缓冲液稀释，得到体积为100μl的工作溶液，并存储在-20℃温度环境下；tris-hcl缓冲液的ph值为8.0；主蛋白酶测定缓冲液的成分包括浓度为20mm的tris-hcl缓冲、浓度为150mm的nacl、浓度为1mm的dtt和体积分数为5％的甘油；木瓜蛋白酶样蛋白酶测定缓冲液的成分包括浓度为20mm的tris和浓度为500mm的nacl，木瓜蛋白酶样蛋白酶测定缓冲液的ph值为7.4。
13、作为本专利技术的一个方面，人类呼出气冷凝液在进行酶促反应前，将人类呼出气冷凝液以5000rpm离心5分钟，收集上清液，作为用于酶促反应的人类呼出气冷凝液。
14、作为本专利技术的一个方面，酶促反应的反应条件为：在37℃、ph为7.0的条件下孵育60min。
15、作为本专利技术的一个方面，脂质双层膜通过跨越delrin双层杯中150μm的孔形成；delrin双层杯分为顺式腔和反式腔，两腔内均填充有1ml反应缓冲液；反应缓冲液的成分由3m kcl、25mm hepes和1mm edta组成，ph值为7.0。
16、作为本专利技术的另一个方面，将酶促反应后得到的10μl样品填充至delrin双层杯的顺式腔内，使用集成膜片钳放大器配备digidata 1440a转换器记录电流轨迹；分析条件为：通过软件pclamptm10.6、和originlab 2019对电流轨迹进行分析。
17、说明：通过气溶素纳米孔易位时，mpro催化和plpro催化的裂解反应的底物肽和消化片段可以产生特征事件。通过监测特定的瞬态离子电流调制，能够定量分析了酶活性。
18、作为本专利技术的一个方面，主蛋白酶对应检测产生的电流阻塞为0.32～0.53，木瓜蛋白酶样蛋白酶对应检测产生的电流阻塞为0.47～0.65；电流阻塞为有样品通过aerolysin纳米孔时的电流值与无样品通过aerolysin纳米孔时的开孔电流值的比值。
19、说明：本专利技术提供的方法可以直接通过电流阻塞判定人类呼出气冷凝液中是否含有主蛋白酶和木瓜蛋白酶样蛋白酶。
20、本专利技术的有益效果是：
21、本专利技术通过对多肽底物探针的精确设计，结合aerolysin纳米孔极高的空间分辨率，该方法可以通过aerolysin纳米孔同时检测和准确区分两种蛋白酶，使得mpro和plpro的检测灵敏度均达到了前所未有的高水平，无需标记和扩增；最重要的是，通过调节多肽探针序列，这种简单方便的基于多肽的传感方法可以发展成为一种适用于不同类型酶的通用方法，从而在无创疾病诊断中具有很大的潜力。
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1.一种多肽底物探针，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种如权利要求1所述的多肽底物探针在同时检测主蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶中的应用。
3.一种同时检测主蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶的方法，基于权利要求1所述的一种多肽底物探针，其特征在于，通过所述多肽底物探针对人类呼出气冷凝液进行同时检测分析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多肽底物探针基于aerolysin纳米孔对主蛋白酶和木瓜蛋白酶样蛋白酶进行同时检测分析。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过Delrin双层杯形成脂质双层膜，并通过aerolysin溶液将aerolysin纳米孔蛋白自发插入脂质双分子层中，形成aerolysin纳米孔。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在同时检测分析前，配置aerolysin溶液、储备液、工作溶液，并将所述储备液、工作溶液与人类呼出气冷凝液混合进行酶促反应。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述aerolysin溶液的配置方法为：将浓度为2.0m
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人类呼出气冷凝液在进行酶促反应前，将人类呼出气冷凝液以5000rpm离心5分钟，收集上清液，作为用于酶促反应的人类呼出气冷凝液。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酶促反应的反应条件为：在37℃、pH为7.0的条件下孵育60min。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述同时检测分析的检测条件为：将酶促反应后得到的10μL样品填充至Delrin双层杯的顺式腔内，使用集成膜片钳放大器配备DigiData 1440a转换器记录电流轨迹；分析条件为：通过软件PClampTM10.6、和OriginLab 2019对电流轨迹进行分析。
...【技术特征摘要】
1.一种多肽底物探针，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no：1所示。
2.一种如权利要求1所述的多肽底物探针在同时检测主蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶中的应用。
3.一种同时检测主蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶的方法，基于权利要求1所述的一种多肽底物探针，其特征在于，通过所述多肽底物探针对人类呼出气冷凝液进行同时检测分析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多肽底物探针基于aerolysin纳米孔对主蛋白酶和木瓜蛋白酶样蛋白酶进行同时检测分析。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过delrin双层杯形成脂质双层膜，并通过aerolysin溶液将aerolysin纳米孔蛋白自发插入脂质双分子层中，形成aerolysin纳米孔。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在同时检测分析前，配置aerolysin溶液、储备液、工作溶液，并将所述储备液、工作溶液与人类呼出气冷凝液混合进行酶促反应。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述aerolysin溶液的配置方法为：将浓度为2.0mg/ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：郗冬梅，周鑫，姜耀，褚白雪，张书圣，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：
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