【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及到一种快速提取细菌基因组dna用的方法和试剂及其应用。
技术介绍
1、病原菌感染对全球公共卫生安全具有极大危害。传统的病原菌检测技术如培养法需要耗费大量的时间，基于免疫学检测的方法灵敏度较低无法满足检测需求。基于分子生物学的检测方法如pcr等能够对病原菌进行高灵敏度、高特异性、快速检测。但是利用分子生物学的方法对进行核酸扩增的首要条件是进行核酸提取。核酸提取步骤获得的核酸浓度与纯度直接影响后续检测反应的成功与否。常见的核酸提取方法有基于磁珠的磁珠法和基于硅胶膜的离心柱法。磁珠法提核酸的原理是将磁珠表面进行不同材料或者集团的修饰。不同材料和集团与核酸的结合力不同，主要有离子键和共价键结合。因此，采用磁珠法提核酸的重中之重在于提高核酸与磁珠的结合能力。基于硅胶膜的离心柱法其原理主要是依靠正负电吸附核酸。硅胶膜表面的硅醇基团呈弱酸性，其水化后带负电。在高盐水溶液状态下，形成的阳离子桥能够中和dna和硅醇基团之间的表面负电荷，从而使dna牢固地吸附在硅胶膜表面。反之，处于低盐水溶液状态下时，由于硅胶膜的硅醇基团与dna磷酸基团之间的静电排斥，硅胶膜释放dna。采用磁珠法进行核酸提取，由于需要对磁珠表面进行不同集团的修饰，所以该方法的成本较高。并且磁珠法核酸提取依赖磁珠与核酸的结合力以及磁珠的磁性，所以磁珠法的提取效率往往比离心柱法低。而离心柱法的操作较为简单、成本更为低廉、提取的效果更有优势。
2、现有基于离心柱法提取核酸的试剂存在操作时间长，操作流程多，提取效果差的缺点。并且，提取试剂中广泛含有
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术提出了一种快速细菌核酸提取试剂盒。整个提取过程不超过10分钟且提取试剂中不含有挥发性有机溶剂，可以最大程度的保护操作人员。该试剂盒具有核酸得率高、实验操作简单、生物安全性高、提取时间短等优点，可广泛用于病原菌核酸提取。
2、有鉴于此，本专利技术的第一个目的在于提供一种细菌快速核酸提取试剂盒。该试剂盒提取后的核酸可以用于rpa-cas12a等温反应进行大肠杆菌检测。本专利技术的第二个目的在于提供一种无挥发性有机试剂的细菌核酸提取试剂盒，可以简单快速的对核酸进行纯化来满足rpa-cas12a等温反应的需求。
3、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种快速细菌基因组dna提取试剂盒，所述试剂盒的试剂包括裂解液、加强液、清洗液和洗脱液，所述裂解液包括多种表面活性剂的组合物；所述加强液为盐酸胍和异硫氰酸胍一种或两种；所述清洗液包括盐酸胍、乙酸甲、糖原和mops中的一种或者多种组合；所述洗脱液包括te缓冲液。
4、进一步的，所述表面活性剂为triton x-100、sds和np-40；triton x-100的浓度为1～10％，sds的浓度为1～1％，np-40的浓度为1～10％；优选的triton x-100的浓度为5％，sds的浓度为0.05％，np-40的浓度为2％。
5、进一步的，所述裂解液还包括：edta浓度为1～10mm，优选1～5mm，最优选为2mm；nacl浓度为10～100mm，优选20～60mm，最优选为50mm；海藻糖的浓度为0.1～5m，优选0.1～1m，最优选为0.5m；tris-hcl调整ph为7～8之间。
6、进一步的，所述加强液中盐酸胍的浓度为1m～10m；异硫氰酸胍的浓度为1m～10m；优选的盐酸胍的浓度为6m。
7、进一步的，所述清洗液中盐酸胍的浓度为0～1mm，醋酸钾的浓度为0～1mm，糖原的浓度为0～1m/v％，mops的浓度为1～20mm；优先的，盐酸胍的浓度为0.1m，醋酸钾的浓度为0.15m，糖原的浓度为0.05％m/v，mops的浓度为2mm。
8、进一步的，所述te缓冲液包括10mm的tris-hcl和1mm的edta。
9、一种所述的快速细菌基因组dna提取试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
10、步骤一.将样品溶液离心处理得到样品；
11、步骤二.在步骤一得到的样品中加入200μl裂解液和加强液，混匀后95℃加热5min；12000rpm离心1min，弃废液；
12、步骤三.在步骤二得到的样品中加入500μl清洗液，12000rpm离心1min，弃废液；
13、步骤四.在步骤三得到的样品中加入200μl洗脱液，56℃孵育5min，12000rpm离心1min，所得即为提取的细菌dna。
14、一种所述的快速细菌基因组dna提取试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒适用于菌液、尿液、唾液、奶粉等样品的细菌核酸提取。
15、本专利技术与现有的技术相比，具有如下优点：(1)本专利技术的试剂盒能够从多种样品类型中如奶粉、尿液、唾液等对细菌进行核酸提取。(2)本专利技术的操作简单，步骤流程少，提取时间短。(3)本专利技术的试剂盒中不含有挥发性的有机溶剂，可以最大程度的保护实验人员。(4)本专利技术无需复杂的核酸提取设备，只需简单的离心机和水浴锅即可。
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1.一种快速细菌基因组DNA提取试剂盒，所述试剂盒的试剂包括裂解液、加强液、清洗液和洗脱液，其特征在于：所述裂解液包括多种表面活性剂的组合物；所述加强液为盐酸胍和异硫氰酸胍一种或两种；所述清洗液包括盐酸胍、乙酸甲、糖原和MOPS中的一种或者多种组合；所述洗脱液包括TE缓冲液。
2.根据权利要求1所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为Triton X-100、SDS和NP-40；Triton X-100的浓度为1 ~ 10%，SDS的浓度为1 ~ 1%，NP-40的浓度为1 ~ 10%；优选的Triton X-100的浓度为5%，SDS的浓度为0.05%，NP-40的浓度为2%。
3.根据权利要求2所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液还包括：EDTA浓度为1 ~ 10 mM，优选1 ~ 5 mM，最优选为2 mM；NaCl浓度为10 ~ 100 mM，优选20 ~ 60 mM，最优选为50 mM；海藻糖的浓度为0.1 ~ 5 M，优选0.1 ~ 1 M，最优选为 0.5M；Tris-HCl调整PH为7 ~
4.根据权利要求1所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述加强液中盐酸胍的浓度为1 M ~ 10 M；异硫氰酸胍的浓度为1 M ~ 10 M；优选的盐酸胍的浓度为6M。
5.根据权利要求1所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液中盐酸胍的浓度为0 ~ 1 mM，醋酸钾的浓度为0 ~ 1 mM，糖原的浓度为0 ~ 1 m/v%，MOPS的浓度为 1 ~ 20 mM；优先的，盐酸胍的浓度为0.1 M，醋酸钾的浓度为0.15 M，糖原的浓度为0.05%m/v，MOPS的浓度为 2 mM。
6.根据权利要求1所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述TE缓冲液包括10 mM的Tris-HCl和1 mM的EDTA。
7.一种根据权利要求1-6任一项所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法，其特征在于包括如下步骤：
8.一种根据权利要求1-7任一项所述的快速细菌基因组DNA提取试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒适用于菌液、尿液、唾液、奶粉等样品的细菌核酸提取。
...【技术特征摘要】
1.一种快速细菌基因组dna提取试剂盒，所述试剂盒的试剂包括裂解液、加强液、清洗液和洗脱液，其特征在于：所述裂解液包括多种表面活性剂的组合物；所述加强液为盐酸胍和异硫氰酸胍一种或两种；所述清洗液包括盐酸胍、乙酸甲、糖原和mops中的一种或者多种组合；所述洗脱液包括te缓冲液。
2.根据权利要求1所述的快速细菌基因组dna提取试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为triton x-100、sds和np-40；triton x-100的浓度为1 ~ 10%，sds的浓度为1 ~ 1%，np-40的浓度为1 ~ 10%；优选的triton x-100的浓度为5%，sds的浓度为0.05%，np-40的浓度为2%。
3.根据权利要求2所述的快速细菌基因组dna提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液还包括：edta浓度为1 ~ 10 mm，优选1 ~ 5 mm，最优选为2 mm；nacl浓度为10 ~ 100 mm，优选20 ~ 60 mm，最优选为50 mm；海藻糖的浓度为0.1 ~ 5 m，优选0.1 ~ 1 m，最优选为 0.5m；tris-hcl调整ph为7 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：王伟洪，钱福初，尹维宏，牟颖，胡凯，金伟，童照威，钟剑峰，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：
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