【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种taq dna聚合酶(δ260-264+e713g)突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、taq dna聚合酶是1988年，saiki等首次从生长在70-75℃火山温泉中生长的水生栖热菌(thermus aquaticus)中分离得到，并成功应用到pcr技术中。不但实现了pcr自动化，也因为提高退火温度和延伸温度而提高了产物特异性。野生型taq dna聚合酶全长832aa，相对分子量94kda，理论总平均亲水指数为-0.282。该酶具有良好的耐热性，最适催化温度为75-80℃，95℃半个小时仍能保留50％左右的活性。具有5’-3’聚合酶活性，同时还具有一定的5’-3’外切核酸酶活性，此外，还可在pcr产物3’末端加a。
2、近年来，dna聚合酶在分子诊断领域发挥着重要作用，但是，当前商业化的耐热dna聚合酶在热稳定性、合成能力、速度、保真度和特异性等方面的性能不尽相同。目前我国分子诊断，测序等需求日益增大，需要生产成本更低，活性更高，热稳定性更强，合成能力、合成速度和特异性等性能更强的taq dna聚合酶来满足市场需求。
3、目前，缺乏一种热稳定性高的taq dna聚合酶突变体及其制备方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种热稳定性高的taq dna聚合酶突变体及其制备方法。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术的一种taq dna聚合酶突变体，taq dna聚合
3、本专利技术编码taq dna聚合酶突变体的基因。以提高taq dna聚合酶(δ260-264+e713g)突变体在原核表达时的表达量，本专利技术还公开了一种针对大肠杆菌密码子优化后的taq dna聚合酶(δ260-264+e713g)突变体优化基因序列。
4、进一步地，taq dna聚合酶突变体的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。该基因序列根据大肠杆菌密码子偏嗜性进行优化设计。其表达蛋白多以可溶性蛋白形式存在，可以提高纯化蛋白的得率，其表达效果如图3所示，其中上清组份中可溶性taq dna聚合酶(δ260-264+e713g)突变体蛋白表达量远高于沉淀组份，taq dna聚合酶(δ260-264+e713g)突变体在95℃放置30分钟，仍具有80％活性。
5、本专利技术的一种包含新型taq dna聚合酶突变体编码序列的重组表达载体。
6、本专利技术的一种包含重组表达载体的重组菌株。
7、本专利技术的一种重组表达载体的重组细胞。
8、进一步地，重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。并被重组表达载体所转化。
9、本专利技术的一种制备新型taq dna聚合酶突变体的方法，包括如下步骤：
10、(1)合成编码taq dna聚合酶突变体基因序列；
11、(2)构建高效重组表达载体，得到重组质粒pet-taqe713g；
12、(3)用所述重组表达载体转化宿主菌bl21(de3)构建重组表达菌；
13、(4)利用所获得的重组表达菌的培养表达taq dna聚合酶突变体；
14、(5)将步骤(4)所获得的表达产物的分离纯化，制得taq dna聚合酶突变体。
15、进一步地，在步骤(2)中，采用标准pcr技术扩增taq dna聚合酶新型突变体(δ260-264+e713g)基因，并在两端入加限制性酶切位点(ecor i,sal i)，限制酶酶切后，装在pet32a(+)载体相应酶切位点间，转化克隆宿主，筛选测序，制备质粒pet-taqe713g。
16、进一步地，在步骤(2)中，编码基因的特异性引物对为taqmut-ecor i-f/r；引物taqmut-ecor i-f具有seq id no.4的核苷酸序列；引物taqmut-ecor i-r具有seq id no.5的核苷酸序列。
17、采用标准pcr技术在片断的首尾引入合适的限制性酶切位点，装配入质粒pet-11a(novagen公司产品)转化宿主细胞，完成工程菌的构建。
18、将构建好的工程菌发酵，离心得到菌体，洗涤后破菌，离心收集上清，随后采用镍粒子亲和层析纯化蛋白，纯化的蛋白加入稳定剂后低温储存。
19、有益效果：本专利技术提高了重组taq dna聚合酶的可溶性和热稳定性，生产成本更低，活性更高的taq dna聚合酶来满足市场需求。
20、与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
21、(1)提高了其在原核表达时的表达量，表达蛋白多以可溶性蛋白形式存在，可以提高纯化蛋白的得率，其中上清组份中可溶性taq dna聚合酶蛋白表达量远高于沉淀组份，重组taq dna聚合酶在95℃处理30分钟，其活性保留80％以上。
22、(2)本专利技术提高了taq dna聚合酶的扩增效率。相同反应条件下可以得到更多的pcr产物，本专利技术比较了野生型taq dna聚合酶与本专利技术的重组taq dna聚合酶扩增效果，重组dna聚合酶产生了更多的pcr产物。
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1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于：所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述的Taq DNA聚合酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.包含权利要求2所述的Taq DNA聚合酶突变体编码序列的重组表达载体。
5.包含权利要求4所述的重组表达载体的重组菌株。
6.权利要求4所述的重组表达载体的重组细胞。
7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.一种制备权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体的方法，其特征在于包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的Taq DNA聚合酶突变体的方法，其特征在于：在步骤(2)中，采用标准PCR技术扩增Taq DNA聚合酶新型突变体(Δ260-264+E713G)基因，并在两端入加限制性酶切位点(EcoRI,Sal I)，限
10.根据权利要求8所述的Taq DNA聚合酶突变体的方法，其特征在于：在步骤(2)中，编码基因的特异性引物对为Taqmut-EcoR I-F/R；引物Taqmut-EcoR I-F具有SEQ ID NO.4的核苷酸序列；引物Taqmut-EcoR I-R具有SEQ ID NO.5的核苷酸序列。
...【技术特征摘要】
1.一种taq dna聚合酶突变体，其特征在于：所述taq dna聚合酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.编码权利要求1所述的taq dna聚合酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述的taq dna聚合酶突变体的基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
4.包含权利要求2所述的taq dna聚合酶突变体编码序列的重组表达载体。
5.包含权利要求4所述的重组表达载体的重组菌株。
6.权利要求4所述的重组表达载体的重组细胞。
7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
8.一种制备权利要求1所述的taq dna聚合...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨洋，汪寄宇，
申请(专利权)人：上海馨瑷生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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