用于扩增NK细胞的RNA组合物及基于其的基因修饰NK细胞药物制剂制造技术

技术编号：40664158 阅读：14 留言：0更新日期：2024-03-18 18:58

本发明专利技术涉及基因工程及细胞培养技术领域，具体涉及用于扩增NK细胞的RNA组合物及基于其的基因修饰NK细胞药物制剂。本发明专利技术提供了一种用于扩增NK细胞的RNA组合物，其编码的目标多肽包括由IL‑2多肽、IL‑7多肽、IL‑12多肽、IL‑15多肽、IL‑18多肽、IL‑21多肽、4‑1BBL多肽、CD16α多肽和IFN‑γ多肽组成的组中的一种或多种。通过利用多种手段向PBMC细胞、PBMC细胞中的非NK细胞和/或NK细胞递送上述RNA组合物，用于体外高效稳定的扩增NK细胞，并可利用该RNA组合物进一步对收获的NK细胞进行基因修饰，从而开发能够用于临床治疗的NK细胞药物制剂。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程及细胞培养，具体涉及用于扩增nk细胞的rna组合物及基于其的基因修饰nk细胞药物制剂。

技术介绍

1、自然杀伤细胞(natural killer cell，nk cell)是机体固有免疫系统的重要组成部分，在机体抵抗病毒感染、病原体入侵及肿瘤免疫中发挥至关重要的作用。不同于t细胞，nk细胞在发挥功能时不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility，mhc)的限制，通过其表面抑制性受体kirs、nkg2a等及活化受体如nkp30、nkp44、nkp46及nkg2d之间的相互作用来发挥效应功能。此外因nk细胞表面表达cd16α(fcγrⅲα)，能够特异性结合抗体fc端，与单克隆抗体联用后可发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(adcc，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)效应介导杀伤功能。nk细胞一旦被活化，无需事先致敏即可快速裂解肿瘤细胞或病毒感染细胞。

2、近年来，随着car-t免疫疗法的兴起与发展，基于nk细胞的car-nk免疫疗法也应运而生。相对car-t免疫疗法，有研究显示在发挥相同抗肿瘤疗效的基础上，car-nk的安全性要显著优于car-t细胞。car-nk细胞回输后可显著降低免疫细胞回输后引起的毒副反应，如细胞因子风暴、神经毒性等。目前已有多家公司如fate therapeutics，cytoviatherapeutics等纷纷布局car-nk疗法。

3、目前nk细胞来源主要有工程细胞株nk

4、目前常用的nk细胞体外扩增方法主要有两种：饲养细胞刺激扩增和多因子刺激扩增。利用饲养细胞刺激扩增时常用的饲养细胞为表达il-15或il-21及4-1bbl的k562细胞。临床应用时需要考虑终制剂中k562细胞的残留及安全性问题。另外，利用il-2、il-7、il-12、il-15、il-18及il-21等多因子刺激nk扩增时，nk细胞增殖能力有限，纯度较低，个体差异性较大，制备成本高昂。并且在终产品安全性评估中引入的多种细胞因子均需额外考虑。

5、如何实现nk细胞高效率、可重复性(减少扩增效率个体差异性)、安全(无外源因子无额外引入k562饲养细胞外源细胞)、经济(成本可控)的体外扩增，是困扰nk细胞临床应用的一大难题。

6、nk制剂输注到体内后半衰期较短，未经基因修饰的nk细胞杀伤能力和存活时间不如基因修饰的t细胞，为了提高nk细胞体内存活时间，并且提高nk细胞体内对肿瘤的杀伤能力，并激活全身免疫反应，需要对扩增后的nk细胞进行基因修饰。由于常用的慢病毒(lentivirus)基因修饰方法对nk细胞基因转染效率较低，常用腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)或电转的方式进行扩增后nk细胞基因修饰。但由于人体内预存的aav抗体，采用aav修饰会引起一定的免疫反应，此外aav制备过程复杂成本高昂，不利于临床推广。电转是采用瞬时电流刺激物理方式实现基因转染，但是常规电转dna的方式存在基因整合的安全性问题。

技术实现思路

1、专利技术要解决的问题

2、目前，常用的nk细胞体外扩增方法存在饲养细胞和刺激因子残留、nk细胞增殖能力有限、纯度低、个体差异性大、制备成本高的问题，并且扩增后的nk细胞制剂还存在着体内存活时间短、杀伤能力有限、基因修饰方式存在安全隐患的问题。为了解决上述缺陷，本专利技术提供一种用于扩增nk细胞的rna组合物及基于其的基因修饰nk细胞药物制剂，利用多种手段向外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmc)、pbmc细胞中的非nk细胞和/或nk细胞递送rna组合物，用于体外高效扩增nk细胞，并可利用该rna组合物进一步对收获的nk细胞进行基因修饰，从而开发能够用于临床治疗的nk细胞药物制剂。

3、用于解决问题的方案

4、[1]、一种用于扩增nk细胞的rna组合物，其编码的目标多肽包括由il-2多肽、il-7多肽、il-12多肽、il-15多肽、il-18多肽、il-21多肽、4-1bbl多肽、cd16α多肽和ifn-γ多肽组成的组中的一种或多种。

5、[2]、根据[1]所述的rna组合物，其特征在于，所述rna组合物包含如下(a)～(c)所示的mrna中的一种或多种，或者，所述rna组合物包含如下(d)所示的mrna：

6、(a)包含编码il-15多肽的第一编码序列的第一mrna；

7、(b)包含编码il-21多肽的第二编码序列的第二mrna；

8、(c)包含编码4-1bbl多肽的第三编码序列的第三mrna；

9、(d)包含编码重组多肽的第四编码序列的第四mrna，其中，所述第四编码序列包含如下任意两种或多种：编码il-15多肽的第一编码序列、编码il-21多肽的第二编码序列、编码4-1bbl多肽的第三编码序列。

10、进一步地，

11、所述第一编码序列包含如seq id no.2所示的序列，或与seq id no.2所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有il-15多肽活性的多肽的序列；

12、所述第二编码序列包含如seq id no.6所示的序列，或与seq id no.6所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有il-21多肽活性的多肽的序列；

13、所述第三编码序列包含如seq id no.10所示的序列，或与seq id no.10所示的序列具有至少80％的序列同一性，且编码具有或部分具有4-1bbl多肽活性的多肽的序列。

14、进一步地，

15、所述第一mrna中还包含编码il-15rα多肽的第五编码序列；

16、所述第二mrna中还包含编码cd8铰链区多肽的第六编码序列、编码cd8跨膜区多肽的第七编码序列和编码cd8胞内区多肽的第八编码序列。

17、[3]、根据[1]或[2]所述的rna组合物，其特征在于，所述rna组合物中的各mrna彼此独立地选自线本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种用于扩增NK细胞的RNA组合物，其编码的目标多肽包括由IL-2多肽、IL-7多肽、IL-12多肽、IL-15多肽、IL-18多肽、IL-21多肽、4-1BBL多肽、CD16α多肽和IFN-γ多肽组成的组中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的RNA组合物，其特征在于，所述RNA组合物包含如下(a)～(c)所示的mRNA中的一种或多种，或者，所述RNA组合物包含如下(d)所示的mRNA：

3.根据权利要求1或2所述的RNA组合物，其特征在于，所述RNA组合物中的各mRNA彼此独立地选自线状mRNA或环状mRNA；

4.根据权利要求1～3中任一项所述的RNA组合物在如下(e)～(f)至少一项中的用途：

5.一种扩增NK细胞的方法，其包括如下(i)～(ii)所示的步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述制备饲养细胞的步骤中，所述RNA组合物中每种RNA的用量各自独立地与所述待处理的细胞个数的比例为(10μg～50μg)：(1×107个)；优选的，所述RNA组合物的总的用量为1μg～1mg；