【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因药物构建一种靶向肌萎缩侧索硬化症或神经退行性疾病的慢病毒质粒及其构建方法和应用。
技术介绍
1、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，als)是一种少见病，其发病率与患病率因年龄、性别、种族和地域而不同。在美国及欧洲等相关国家，als发病率为1～2人/10万人˙年,患病率为3～5人/10万人˙年。marin(marin b,boumédiene f,etal.variation in worldwide incidence of amyotrophic lateral sclerosis:a meta-analysis.int j epidemiol.2016may16.pii:dyw061.)等一项有关世界范围内als流行病学调查的meta分析显示，als发病率为1.75人(或1.55～1.96)/10万人˙年；其中，男性发病率比女性稍高，为2.03人(1.79～2.37)/10万人˙年，女性为1.45人(1.25～1.64)/10万人年。logroscino(logroscino g,piccininni m.amyotrophic lateral sclerosisdescriptive epidemiology:the origin of geographic difference.neuroepidemiology.2019；52(1-2):93-103.doi:10.1159/000493386.epub 2019 jan2.pmid:30602169)等报道
2、中国als的发病率约0.6/10万人˙年，患病率约3.1/10万人˙年。国内liu(liu x,hej,gao fb,gitler ad,fan d.the epidemiology and genetics of amyotrophic lateralsclerosis in℃hina.brain res.2018 aug 15；1693(pt a):121-126.doi:10.1016/j.brainres.2018.02.035.epub 2018mar 1.pmid:29501653)等对中国10个als中心455个散发性als的研究结果显示，中国als发病年龄早于发达国家，中位发病年龄为52岁，散发性als男性高发年龄为55～59岁，女性为45～49岁，男性发病比女性多，大约为1.6:1。
3、目前市场上针对als的药物主要有一下两种：一种是利鲁唑(riluzole)，能使生存期平均延长2-3个月，对延髓型效果较好，在早期效果也较好；其机理暂未有充分的阐明，目前归结于对突触前谷氨酸的抑制作用上，但抑制了兴奋性神经递质会影响到患者的精神和运动的衰弱；该药物并发症较为复杂，因此会需要很多药物控制并发症的发生；另一种是依达拉奉(edaravone)，来自日本，能减轻als中各种身体机能的失能，但只对小部分早发型有效；其机理可能是通过抑制细胞过度氧化损伤，从而对神经元进行保护；该药物也有严重的副作用，而且费用高达14万美元一年。
4、上述两种以外的其他类似药物，如，减轻患者疾病痛苦的药物，主要包括减轻神经痛、缓解疲惫、放松肌肉、抗痉挛、抑制口水和痰等外在症状的药物；还有一些抗抑郁、抗焦虑等精神药物以及一些对认知功能有帮助的药品。
5、然而，至今世界各国还未有相关政府获批的治疗als的基因药物，况且，在做临床试验的基因治疗药物液也只是针对某种亚型的家族性als(sod g93a或℃9orf72)的病人。
6、因此，研究一种针对所有als病人的基因治疗药物很有必要。
技术实现思路
1、基于上述问题，本专利技术所要解决的问题在于提供一种通过保护神经元来靶向als症状的慢病毒质粒及其构建方法和应用。
2、本专利技术的慢病毒质粒，其骨架中插入有arfaptin-2短干扰sirna基因片段；其中，阿夫丁-2(arfaptin-2)基因序列片段，阿夫丁-2短干扰rna(short interfering rna，sirna)沉默阿夫丁-2起到激活泛素-蛋白酶体系统作用；蛋白酶体酶系统活性低下是有害蛋白凝固原因，也是als及其他神经退行性疾病的共同发表机理，其中也包括帕金森氏症(pd)，阿尔茨海默病(ad)等。
3、较好地，上述慢病毒质粒中，所述sirna基因片段的shrna引物选自如下任一组：
4、shrna1引物，以sirna-arfaptin-2_471为模板；或
5、shrna2引物，以sirna-arfaptin-2_480为模板；或
6、shrna3引物，以sirna-arfaptin-2_749为模板。
7、对于上述shrna引物，可以选自三组，分别是shrna1引物、shrna2引物、shrna3引物，各shrna引物设计如下：
8、①、shrna1引物中，正义链核酸序列如seq id no:11所示、反义链核酸序列如seqid no:12所示；或者
9、②、shrna2引物中，所述shrna2引物中，正义链核酸序列如seq id no:21所示、反义链核酸序列如seq id no:22所示；或者
10、③、shrna3引物中，正义链核酸序列如seq id no:31所示、反义链核酸序列如seqid no:32所示。
11、上述慢病毒质粒，可以被用来构建慢病毒，其构建方法如下：
12、获取慢病毒质粒的骨架及含arfaptin-2基因序列的质粒；
13、使用以arfaptin-2基因序列，设计获得arfaptin-2短干扰sirna基因序列；
14、以arfaptin-2短干扰sirna基因序列为模板，用内切酶切下arfaptin-2短干扰sirna基因片段；
15、用内切酶将arfaptin-2短干扰sirna基因片段插入慢病毒质粒的骨架中，获得含arfaptin-2短干扰sirna基因片段的慢病毒质粒。
16、较好地，在上述慢病毒质粒的构建方法中，内切酶为mlu1-hf和cla1。
17、上述慢病毒质粒构建的慢病毒，可以被用来制备治疗肌萎缩侧索硬化症和/或神经退行性疾病的药物。
18、上述慢病毒质粒还可以被用来构建重组细胞系、宿主细胞系、生物制剂等，且所构建的重组细胞系、宿主细胞系、生物制剂等也可以被用来制备治疗肌萎缩侧索硬化症和/或神经退行性疾病的药物。
19、本专利技术提供的慢病毒质粒或慢病毒，其骨架中插入有arfaptin-2短干扰sirna基因片段；arfaptin-2短干扰rna(short interfering rna，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种慢病毒质粒，其特征在于，所述慢病毒质粒的骨架中插入有Arfaptin-2短干扰siRNA基因片段。
2.根据权利要求1所述的慢病毒质粒，其特征在于，所述siRNA基因片段的shRNA引物选自如下任一组：
3.根据权利要求2所述的慢病毒质粒，其特征在于，所述shRNA1引物中，正义链核酸序列如SEQ ID NO:11所示、反义链核酸序列如SEQ ID NO:12所示。
4.根据权利要求2所述的慢病毒质粒，其特征在于，所述shRNA2引物中，正义链核酸序列如SEQ ID NO:21所示、反义链核酸序列如SEQ ID NO:22所示。
5.根据权利要求2所述的慢病毒质粒，其特征在于，所述shRNA3引物中，正义链核酸序列如SEQ ID NO:31所示、反义链核酸序列如SEQ ID NO:32所示。
6.一种慢病毒，其特征在于，该慢病毒包含权利要求1至5任一所述的慢病毒质粒。
7.一种生物制剂，其特征在于，该生物制剂包含权利要求1至5任一所述的慢病毒质粒，或者包含权利要求6所述的慢病毒。
8.一种
9.一种宿主细胞系，其特征在于，该重组细胞系包含权利要求1至5任一所述的慢病毒质粒，或者包含权利要求6所述的慢病毒。
10.一种如权利要求1所述的慢病毒质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述内切酶为ClaI和MluI-HF。
12.一种治疗肌萎缩侧索硬化症和/或神经退行性疾病的药物；其特征在于，该药物包含权利要求1至5任一所述的慢病毒质粒，或者包含权利要求6所述的慢病毒，或者包含权利要求7所述的生物制剂，或者包含权利要求8所述的重组细胞系，或者包含权利要求9所述的宿主细胞系。
...【技术特征摘要】
1.一种慢病毒质粒，其特征在于，所述慢病毒质粒的骨架中插入有arfaptin-2短干扰sirna基因片段。
2.根据权利要求1所述的慢病毒质粒，其特征在于，所述sirna基因片段的shrna引物选自如下任一组：
3.根据权利要求2所述的慢病毒质粒，其特征在于，所述shrna1引物中，正义链核酸序列如seq id no:11所示、反义链核酸序列如seq id no:12所示。
4.根据权利要求2所述的慢病毒质粒，其特征在于，所述shrna2引物中，正义链核酸序列如seq id no:21所示、反义链核酸序列如seq id no:22所示。
5.根据权利要求2所述的慢病毒质粒，其特征在于，所述shrna3引物中，正义链核酸序列如seq id no:31所示、反义链核酸序列如seq id no:32所示。
6.一种慢病毒，其特征在于，该慢病毒包含权利要求1至5任一所述的慢病毒质粒。...
【专利技术属性】
技术研发人员：宁可，谢海涛，
申请(专利权)人：广东先康达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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